Potencial biotecnológico Haematococcus pluvialis Flotow

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.O crescente interesse no potencial biotecnológico das microalgas deve-se à sua importância nas várias cadeias tróficas mas, principalmente, às diversas substâncias que conseguem sintetizar e que podem ter aplicação comercial em diversas áreas como aquacultura, nutrição, saúde humana e animal, tratamento de águas residuais, produção de energia e nas indústrias alimentar, química, e farmacêutica, entre outras. A grande variabilidade da composição bioquímica da biomassa obtida das culturas de microalgas, aliada ao emprego de melhoramento genético e ao cultivo em grande escala têm permitido a utilização comercial de determinadas espécies, nomeadamente Haematococcus pluvialis. O presente trabalho incide sobre o potencial biotecnológico de uma estirpe de Haematococcus pluvialis Flotow existente na Algoteca da Universidade de Coimbra (ACOI), com o número de referência ACOI 38, tendo sido analisado o crescimento e determinados a composição em ácidos gordos, em pigmentos carotenóides, particularmente astaxantina e o valor antioxidante, tanto de células móveis como de quistos. O crescimento das células móveis e dos quistos foi estimado ao longo de 15 e 20 dias, respetivamente, em condições de cultivo diferentes, realizando-se as curvas de crescimento correspondentes. As células móveis cresceram em meio de cultura líquido M7, sob intensidade luminosa de 5,68μmol m-2 s-1, fotoperíodo de 16h:8h luz/escuro e temperatura ambiente de 23ºC. A biomassa obtida ao fim de 15 dias foi de 0,083g/L. Para o desenvolvimento de quistos as culturas foram sujeitas a um aumento de intensidade luminosa (43,24μmol m-2 s-1) e a borbulhamento com ar, mantendo-se idênticas as restantes condições. A biomassa obtida ao fim de 20 dias foi de 0,450g/L. Foi testada a influência do ácido salicílico na formação de quistos, submetendo-se uma cultura às condições antes referidas, mas com a adição de 50mg/L de ácido salicílico ao meio de cultura. A biomassa total obtida foi de 0,167g/L. O perfil de ácidos gordos foi analisado recorrendo à extração lipídica com os solventes n-hexano e metanol em banho de ultrassons, seguida de transesterificação com metóxido de sódio e injeção das amostras em cromatografia gasosa. Com base nos cromatogramas obtidos e usando um padrão SupelcoTM 37 Component FAME Mix Catalog No. 47885-U e um padrão interno constituído por uma mistura de n-hexadecano (C6) e pentadecanoato de metilo (C15:0) com concentração de 0,03mg/mL, identificaram-se os ácidos gordos presentes, sendo o ácido esteárico o mais abundantenas células móveis (0,088mg) e o ácido palmítico o mais abundante nos quistos com e sem ácido salicílico (0,169mg e 1,097mg, respetivamente), valores por grama de biomassa não seca. Para a identificação dos pigmentos presentes nos quistos efetuou-se cromatografia em coluna, leitura da absorvância no visível das frações eluídas, através de espectrofotometria, e comparação dos espectros de absorção obtidos com os descritos na literatura. Identificaram-se o β-caroteno, a astaxantina e a clorofila a, sendo o β- caroteno o pigmento mais abundante. O potencial antioxidante foi testado através dos ensaios ABTS e DPPH. Pelo ensaio de ABTS as células móveis apresentaram uma atividade antioxidante maior que os quistos com e sem ácido salicílico (6,59mg/L equivalente a ácido ascórbico versus 0,13mg/L equivalente a ácido ascórbico e 2,73mg/L equivalente a ácido ascórbico, respetivamente), comparável ao valor antioxidante da cenoura (5,98mg/L equivalente a ácido ascórbico). Pelo ensaio de DPPH apenas foi possível a medição da atividade antioxidante nas células móveis, tendo-se registado um valor comparável ao do ABTS. Os resultados obtidos comprovam que a estirpe de H. pluvialis ACOI 38 tem potencialidades associadas à alimentação humana saudável. Com efeito, os principais ácidos gordos identificados, mono e polinsaturados, possuem benefícios conhecidos, tais como redução do risco de doenças cardiovasculares, inflamatórias e melhoria das funções cerebrais. O valor antioxidante determinado foi razoável, devendo-se possivelmente aos pigmentos carotenóides identificados nas células, o que demonstra que esta estirpe também poderá ser cultivada para produção dos carotenóides astaxantina e β-caroteno, que têm potenciais aplicações nas indústrias alimentar, química e farmacêutica, entre outras. Contudo, o crescimento mostrou ser lento e baixo, nesta estirpe, pelo que estudos detalhados de cultivo para otimização do crescimento e da produção dos compostos de interesse deverão ser prioritários antes de um eventual uso comercial.The growing interest in the biotechnological potential of microalgae is due to their importance in the food chains but mainly to the many substances they can synthesize which may have commercial application in areas such as aquaculture, nutrition, human and animal health, water treatment waste, energy production and in the food, chemical and pharmaceutical industries, among others. The wide variability of the biochemical composition of the biomass obtained from cultures of microalgae, combined with the genetic improvement and cultivation on a large scale have allowed commercial use of some species such as Haematococcus pluvialis. The present study focuses on the biotechnological potential of a strain of Haematococcus pluvialis Flotow existing in the Algoteca of the University of Coimbra (ACOI), with reference number ACOI 38. Growth was analyzed and determination was done of the fatty acid composition, the main pigments, particularly the carotenoid astaxanthin, as well as the antioxidant value of both the motile cells and the cysts. The growth of motile cells and cysts was estimated during 15 and 20 days, respectively, in different cultivation conditions, corresponding growth curves being established. The motile cells were grown in liquid culture medium M7, under a light intensity of 5.68μmol m-2 s-1, a photoperiod of 16h: 8h light/dark and room temperature of 23 º C. The biomass obtained after 15 days was 0.083g/L. For the development of cysts, cultures were submitted to an increase of light intensity (43,24μmol m-2 s-1) and air bubbling, keeping the other conditions identical. The biomass obtained after 20 days was 0.450g/L. The influence of the salicylic acid was tested in the formation of cysts by subjecting the culture to the conditions referred above with the addition of 50mg/L of salicylic acid to the culture medium. The total biomass obtained was 0.167g/L. The fatty acid profile was analyzed after lipid extraction with the solvents nhexane and methanol in an ultrasonic bath, followed by transesterification with sodium methoxide and injection of samples in gas chromatography. Based on the chromatograms and by using the SupelcoTM 37 Component FAME Mix Catalog No. 47885-U standard and an internal standard containing a mixture of n-hexadecane (C6) and methyl pentadecanoate (C15:0) with a concentration of 0.03mg/mL, the fatty acids were identified, the most abundant being stearic acid in the motile cells (0.088mg fatty acid/g wet biomass) and palmitic acid in the cysts grown with or without salicylic acid (0.169mg fatty acid/g wet biomass and 1,097mg fatty acid/g wet biomass, respectively).The separation of the pigments present in the cysts was done by column chromatography and the identification by reading the absorbance of the collected fractions, and comparing the absorption spectra with those described in the literature. The pigments identified were the β-carotene, astaxanthin and chlorophyll a, β-carotene being the most abundant. The antioxidant potential was tested by the ABTS and DPPH methods. The ABTS assay showed higher antioxidant activity of the motile cells than cysts, either those grown with or without salicylic acid, a value of 6.59mg/L equivalent to ascorbic acid versus 0.13mg/L equivalent to ascorbic acid and 2.73mg/L equivalent to ascorbic acid, respectively, comparable to the antioxidant activity showed by carrot (5.98 mg/L equivalent to ascorbic acid). With the DPPH assay was only possible to measure the antioxidant activity in motile cells, being comparable to the registered ABTS value. The present work shows that this strain of H. pluvialis ACOI 38 has some potential linked to the area of healthy nutrition and, consequently, in the improvement of human health. In fact, the major mono- and polyunsaturated fatty acids identified have many benefits such reducing the risk of cardiovascular and inflammatory diseases, and improving brain functions. The amount of antioxidant activity found was reasonable, possibly due to the carotenoids identified in the cells, indicating that this strain can also be cultivated for the production of β-carotene, astaxanthin and other carotenoids, with potential applications in the food, chemical and pharmaceutical industries, among others. However, growth has proved to be slow in this strain, so detailed cultivation to optimize the growth and production of the compounds of interest should be a prioritie in the next future