Influence of laccases and microRNAs on the lignification of Eucalyptus

Orientador: Paulo MazzaferaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A lignina é um biopolímero fenólico complexo e composto por monolignóis que se organizam aleatoriamente, sendo um dos principais componentes da parede celular, junto com celulose. A lignina afeta fortemente o processo de polpação para produção de pasta de celulose e papel. Os monolignóis são produzidos nas células por diversas enzimas da via de fenilpropanóides e exportados para a fora da célula, na parede celular, onde são oxidados por lacases e peroxidases, e então polimerizados. Neste trabalho, caracterizamos um gene de lacase em eucalipto, EglLAC48, filogeneticamente próxima de AtLAC15 de Arabidopsis, cuja atividade está intimamente associada com a lignificação. A superexpressão de EglLAC48 demonstra recuperação do fenótipo de mutantes lac17 de Arabidopsis deficientes em lignina, principalmente no xilema em desenvolvimento e a localização do mRNA por hibridização in situ evidencia a expressão de EglAC48 no xilema de eucalipto em desenvolvimento. O entendimento das vias de regulação de enzimas efetoras em processos de lignificação pode trazer ferramentas úteis na manipulação de plantas com interesse comercial. miRNAs também vêm se provando importantes efetores na regulação gênica e na produção de fenótipos por meio de transformação e superexpressão de miRNAs de interesse. No presente trabalho pudemos identificar e caracterizar um perfil de expressão de miRNAs e de genes relacionados à lignificação durante o processo de formação de madeira de reação. E. globulus e E grandis apresentaram perfis globais de expressão de miRNAs bastante distintos. Dentre os miRNAs identificados, miRNAs das famílias miR166, miR482, miR168, miR319 e, adicionalmente, quatro miRNAs não-conservados (euc-mir-novel2-3p, euc-mir-novel1-5p, euc-mir-novel6-3p e euc-mir-novel3-3p) foram os dez mais expressos. Uma análise de Gene Ontology mostrou enriquecimento para diversos processos celulares, dentre os quais, de maior relevância para processos de lignificação estão em ligação ao DNA e ligação de íons de cobre. O grupo das lacases se apresenta com muitos alvos preditos para miR397, contudo, alguns dos alvos testados não puderam ser confirmados como alvos de clivagem. Portanto, EglLAC48 se mostra como uma importante lacase no processo de lignificação durante o desenvolvimento inicial do xilema e E. globulus e E. grandis apresentam perfis distintos de expressão de miRNAs e indicando candidatos interessantes relacionados a lignificação por meio de interferência em genes de lacases ou em fatores de transcrição que possam regular genes relacionados a lignificaçãoAbstract: Lignin is a complex phenolic biopolymer formed by randomly organized monolignols and, next to cellulose, is one the main components of plant cell walls. Lignin greatly affects the pulping process during cellulose paste and paper production. Monolignols are produced by enzymes from the phenypropanoid pathway and these compounds are exported out of the cell, to the cell wall, where laccases and peroxidases perform their oxidation, causing their polymerization. Herein we characterized a laccase gene from eucalypt, EglLAC48, which is phylogenetically close to AtLAC15 from Arabidopsis, and is strongly associated with lignification. Overexpression of EglLAC48 demonstrate a phenotypic recovery in lac17 mutants of Arabidopsis that are lignin-deficient, and its mRNA localization shows that EglLAC48 is expressed in the developing xylem of Eucalyptus seedlings. The comprehension of how the pathways that lead to lignification are regulated could bring important tools to produce plants with commercial interest. The miRNAs have also proven to be important genetic regulators in plants. We also identified and characterized an expression profile for miRNAs and genes related to lignification processes using a reaction wood model. E. globulus and E. grandis showed distinct global miRNA expression profiles. Among the miRNAs identified, miRNAs from the miR families miR166, miR482, miR168, miR319 and, additionally, four nonconserved miRNAs (euc-mir-novel2-3p, euc-mir-novel1-5p, euc-mir-novel6-3p and euc-mir-novel3-3p) were the most expressed ones. A Gene Ontology analysis showed enrichment for several cellular processes including DNA binding and copper ion binding, which has a stronger relationship with lignification processes. The group of laccases greatly includes predicted targets for miR397, however, some of the predicted targets could not be confirmed when tested for mRNA cleavage. Therefore, EglLAC48 presents itself as an important laccase in the process of lignification during the initial development of xylem and E. globulus and E. grandis showed distinct expression profiles for miRNAs and possible candidates that may target processes of lignification appeared during our analysesDoutoradoGenética Vegetal e MelhoramentoDoutor em Genetica e Biologia Molecular2014/23230-4FAPES