Analyse structurale et fonctionnelle de la NADPH oxydase des neutrophiles (utilisation de la spectrométrie de masse pour caractériser les changements de conformations de p47(phox) lors de son activation)

La NADPH oxydase (NOX) est un complexe multienzymatique responsable de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) que l'on retrouve dans un grand nombre de types cellulaires. La NOX des neutrophiles est composée de deux protéines transmembranaires (gp91(phox) et p22(phox)), qui constituent le site catalytique, et de trois facteurs cytosoliques (p47(phox), p67(phox) et p40(phox)). Lors de son activation, p47(phox) subit des changements conformationnels que nous tâchons de définir, afin de mieux comprendre la régulation de ce complexe impliqué dans un grand nombre de pathologies. Dans les neutrophiles, les ROS sont responsables de la destruction de pathogènes phagocytés. Il paraît donc primordial de bien comprendre les bases moléculaires du mécanisme d'activation de la NOX pour envisager sa régulation future. Au cours de ce travail, des changemtns conformationnels ont été identifiés sur p47(phox) par protéolyse ménagée et échange H/D couplés à spectrométrie de masse (DXMS). Le relargage de l'AIR, entraînant une meilleure accessibilité du site d'interaction avec p22(phox), a été confirmé et caractérisé d'un point de vue structural et fonctionnel sur protéine entière. De plus, une surface inédite contrôlant l'état autoinhibé a été mise en évidence. La mutagénèse dirigée au sein de cette surface a permis de confirmer cette hypothèse en identifiant deux résidus clés (R162 et D166) responsables de cette autoinhibition et donc susceptibles d'être de futurs candidats de cibles thérapeutiques. Les propriétés d'interactions relatives des divers mutants avec GST-p22(phox)Cter et des liposomes ont été testées par Biacore et cosédimentation, respectivement. L'identification de ces résidus a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de p47(phox), et notamment comment le démasquage de l'AIR phosphorylée entraîne celui du domaine PX. Enfin, une étude méthodologique a montré que la plasmespine 2 de P. falciparum était un nouvel outil susceptible d'améliorer la résolution du DXMS.NADPH oxidase (NOX) is a multienzymatic complex found in many cellular types, responsible for reactive oxygen species (ROS) production. The neutrophilic NOX is composed of two transmembrane proteins (gp91(phox) and p22(phox)) that make up the catalytic core and three cytosolic factors (p47(phox), p67(phox) and p40(phox)). Upon activation, p47(phox), undergoes conformational changes that this study attempts to define in order to better understand the regulation of this complex involved in many diseases. In neutrophils, ROS are responsible for phagocyted pathogen destruction. It therefore appears essential to better understand the molecular bases of the NOX activation mechanism to consider its future regulation. This study has identified a number of conformational changes on p47(phox) by limited proteolysis and Deuterium eXchange coupled to Mass Spectrometry (DXMS). The AIR release, providing better accessibility to the p22(phox) binding site was confirmed and characterized from both structural and functional points of view, on the entire protein. Furthermore, a novel surface controlling p47(phox) auto-inhibited state has been discovered. Site-directed mutagenesis within this surface confirmed this hypothesis by identifying two key residues (R162 and D166) responsible for this auto-inhibition and therefore possible future candidates for therapeutic targets. The relative binding properties of these mutants with GST-p22(phox)Cter and liposomes were investigated using Biacore and pull-down assays, respectively. The identification of these residues provided a better understanding of the p47(phox) activation mechanism, and in particular of how AIR unmasking leads to PX domain release. Finally, a methodological study showed that plasmespin 2 from Plasmdium falciârum was a new tool that may improve DXMS.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF