Biodiversity and activity of microbial decomposers of leaf litter in streams under anthropogenic stress

Tese de Doutoramento em CiênciasHuman activities are threatening biodiversity in freshwaters leading to irreversible alterations in ecosystem processes. One of the most important processes for the functioning of small-forested streams is the decomposition of allochthonous plant litter, which constitutes the major source of nutrients and energy for freshwater food-webs. Microbial decomposers, namely fungi and bacteria, play a critical role in this process degrading leaf material and increasing leaf palatability for invertebrate shredders. An obvious question that arises is in what extent pollution can affect the diversity of microbial decomposers altering the functions they perform in freshwater ecosystems. In a microcosm experiment, we showed that the loss of aquatic fungal species affected fungal biomass and reproduction, but not leaf mass loss. Complementarity effects appeared to occur between fungal species because multicultures had higher performances than those expected from individual performances in monocultures. Moreover, lower fungal biomass and leaf mass loss were found in the absence of Articulospora tetracladia and species identity affected all measured parameters. In a transplant experiment, we investigated how a community of microbial decomposers adapted to a reference site responds to a sudden decrease in the water quality. The transfer of leaves colonized at a reference site to a site with high concentration of nutrients and heavy metals in the stream water reduced fungal diversity and sporulation, but not fungal biomass and leaf decomposition. This suggests that high diversity of fungi may mitigated the impact of anthropogenic stress in streams. Most studies addressing microbial diversity on decomposing leaves rely on the microscopic identification of fungal conidia and on the number of bacterial morphotypes. However, the production of conidia by fungi varies with the species and it is affected by several environmental factors. On the other hand, bacteria have few morphological differences, making it difficult to accurately assess microbial diversity. In our work, DNA fingerprinting techniques were successfully used for assessing fungal and bacterial diversity. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) showed a more diverse microbial community on decomposing leaves than microscopic techniques. Moreover, DGGE allowed detecting shifts in microbial communities during leaf decomposition and under different stress conditions (eutrophication and metal pollution). The structure of fungal and bacterial communities on decomposing leaves changed along a gradient of inorganic nitrogen and phosphorus in streams, as indicated by canonical correspondence analysis based on the morphology of fungal conidia and on DNA fingerprinting. Sporulation was depressed in the most eutrophic streams, while bacterial biomass appeared to be stimulated, except in the presence of high nitrites and ammonium concentrations. Leaf decomposition rate was stimulated at only one site with moderate eutrophication. The exposure of naturally colonized leaves to environmentally realistic concentrations of copper and zinc alone or in mixtures showed that metal exposure altered the structure of fungal and bacterial communities on decomposing leaves. Exposure to metal mixtures or to the highest Cu concentration significantly reduced leaf decomposition rates and fungal reproduction, but not fungal biomass. Bacterial biomass was strongly inhibited by all metal treatments. Moreover, the combined effects of Cu and Zn on microbial decomposition of leaf litter were mostly additive, because observed effects did not differ from those expected as the sum of single metal effects. However, antagonistic effects on bacterial biomass were found in all metal combinations and on fungal reproduction in metal combinations with the highest Cu concentrations, particularly at longer exposure times. Moreover, the sequence by which metals were added to microcosms affected fungal biomass and sporulation, but not bacterial biomass, probably because microbial sensitivities to the metals were different. The resistance of microbial decomposers to Cu did not increase when communities were previously acclimated to Zn and vice-versa. Microbial decomposers could be expending considerable energy to maintain their functions under the stress imposed by the first metal and if so, species resistance might be diminished when the second metal was added. After release from metals, the structure of fungal communities became similar to that of control, as indicated by the principal response curves of sporulating species and also by the DGGE analyses. A recovery of the microbial activity seemed also to occur, as shown by the lack of differences in leaf mass loss, bacterial biomass and fungal reproduction between control and metal treatments.As actividades humanas estão a ameaçar a biodiversidade dos ecossistemas aquáticos, conduzindo a alterações irreversíveis no seu funcionamento. Um dos processos mais importantes para o funcionamento dos ecossistemas de rios de baixa ordem é a decomposição de detritos vegetais alóctones, que constituem a principal fonte de carbono e energia para as cadeias alimentares nesses sistemas de água doce. Os microrganismos decompositores aquáticos, nomeadamente os fungos e as bactérias, desempenham um papel fundamental na decomposição dos detritos vegetais e aumentam a sua palatabilidade para os invertebrados trituradores. Uma questão relevante no âmbito da Ecologia actual é a de saber se a poluição afecta a biodiversidade e quais os impactos para o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Numa experiência em microcosmos, mostrámos que a perda de espécies de fungos aquáticos afectava a biomassa e a reprodução dos fungos, mas não a decomposição de folhada. As espécies de fungos pareceram exibir efeitos de complementaridade uma vez que as culturas mistas tiveram desempenhos superiores ao esperado a partir dos desempenhos em cultura pura. Contudo, a identidade das espécies afectou todos os parâmetros analisados. Além disso, a biomassa dos fungos e a perda de massa foliar foram menores na ausência de Articulospora tetracladia. Numa experiência de transplante de folhas entre rios, investigámos como uma comunidade de microrganismos decompositores adaptados a um local de referência responde a um declínio abrupto na qualidade da água. A transferência de folhas colonizadas num local de referência para um local com concentrações elevadas de nutrientes e metais pesados na água reduziu a diversidade e a esporulação dos fungos, mas não a sua biomassa e a decomposição foliar. Isto sugere que uma elevada diversidade de fungos pode contribuir para atenuar o impacto de stressores antropogénicos nos rios. A maioria dos estudos efectuados tem analisado a diversidade de microrganismos associados a folhas em decomposição com base na identificação microscópica das conídias libertadas pelos fungos e nos tipos morfológicos de bactérias. No entanto, a produção de conídias pelos fungos varia com a espécie e é afectada por vários factores ambientais. Por outro lado, as bactérias possuem poucas diferenças morfológicas entre si, tornando difícil avaliar com exactidão a diversidade microbiana. No nosso trabalho, a electroforese em gradiente desnaturante (DGGE) do DNA microbiano mostrou uma comunidade de fungos e de bactérias mais diversa em folhas em decomposição do que as técnicas de microscopia. O DGGE permitiu detectar alterações na estrutura das comunidades durante a decomposição foliar e em diferentes condições de stresse (eutrofização e poluição por metais). A estrutura das comunidades de fungos e de bactérias nas folhas em decomposição sofreu alterações ao longo de um gradiente de azoto e de fósforo nos rios, como indicado pelas análises de correspondência canónica baseadas na morfologia das conídias dos fungos e no perfil de DGGE. A esporulação diminuiu nos rios mais eutrofizados, enquanto que a biomassa de bactérias pareceu ser estimulada, excepto na presença de concentrações elevadas de nitritos e amónia. A taxa de decomposição foliar foi estimulada apenas num dos locais com eutrofização moderada. A exposição de folhas colonizadas naturalmente a concentrações de cobre e de zinco, ambientalmente realísticas, alterou a estrutura das comunidades de fungos e de bactérias nas folhas em decomposição. A exposição às misturas de metais ou à concentração de Cu mais elevada reduziu significativamente a taxa de decomposição foliar e a reprodução dos fungos, mas não inibiu a biomassa dos fungos. A biomassa bacteriana foi inibida em todos os tratamentos com metais. Além disso, os efeitos combinados do Cu e do Zn na decomposição microbiana da folhada foram maioritariamente aditivos, uma vez que os efeitos observados não diferiram dos esperados a partir da soma dos efeitos de cada metal isolado. No entanto, foram observados efeitos antagonísticos na biomassa de bactérias, em todas as combinações de metais, e na reprodução de fungos nas combinações contendo Cu na concentração mais elevada, particularmente em tempos mais longos de exposição. A sequência pela qual os metais foram adicionados aos microcosmos afectou a biomassa e a esporulação dos fungos, mas não a biomassa das bactérias provavelmente porque a sensibilidade dos microrganismos aos dois metais era diferente. A resistência dos microrganismos decompositores ao Cu não aumentou quando as comunidades foram previamente aclimatadas ao Zn e vice-versa. Os microrganismos poderiam estar a consumir uma fracção de energia considerável para manter as suas funções na presença do primeiro metal e, por este motivo, a sua resistência poderia estar diminuída quando o segundo metal foi adicionado. Após libertação do stresse metálico, a estrutura das comunidades de fungos tornou-se semelhante à das comunidades controlo, como indicado pelas curvas de resposta principal das espécies identificadas a partir dos esporos e pela análise de DGGE. Além disso, a actividade microbiana pareceu recuperar após a libertação do stresse metálico, como sugerido pela ausência de diferenças na perda de massa foliar, na biomassa das bactérias e na reprodução dos fungos entre o controlo e os tratamentos com metais.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/13482/2003