Development of new chitosan based biodegradable blends for bone and cartilage tissue engineering

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais - Engenharia de Tecidos - Materiais HíbridosA number of natural origin polymers are being employed in tissue engineering strategies. Natural origin polymers offer the advantage of being similar to macromolecular substances, which the biological environment is prepared to recognize and to deal with metabolically. Another attractive characteristic of natural polymers is their ability to be degraded by naturally occurring enzymes, implying that the implant will be degraded and eventually metabolized by physiological mechanisms. Chitosan, a mucopolysaccharide, is the alkaline deactylated product of chitin and has structural similarities to glycosaminoglycans, thus, mimicking their functional behaviour. Moreover, it is reported to be typically non-toxic, biodegradable, and biocompatible. Chitosan exhibit a range of properties that make it suitable for use as alternatives to currently used biomaterials, but its mechanical properties and processability are less than ideal which precludes its use as material in load bearing applications. The development of hybrid materials that combine naturally occurring polymers with biocompatible synthetic polymers is expected to be able to minimize the mismatch of mechanical properties and to preserve the functional biocompatibility. However, little research has been conducted in the melt blending of synthetic polyester and chitosan. The main objectives of this thesis were to: i) compound and evaluate the properties of chitosan and biodegradable aliphatic polyesters blends and composites processed using melt based technologies; ii) study the water absorption and degradation characteristics of the produced blends and composites; iii) produce chitosan-based scaffolds with different architectures by melt based technologies.; iv) evaluate their potential cytotoxic behaviour and to conduct direct contact assays aiming to validate their potential use in bone or cartilage tissue engineering applications. The first step of this thesis experimental work was to melt blend chitosan with poly-ε-caprolactone (PCL), poly(butylene succinate) (PBS), poly(lactic acid) (PLA), poly(butylene terephthalate adipate) (PBTA), and poly(butylene succinate adipate) (PBSA). For the chitosan/PBS blend, the amount of chitosan was varied from 25% to 70% by weight. The remaining polyesters had 50% of chitosan by weight. The morphology, tensile and thermal properties of the produced blends were evaluated. Composites consisting of hydroxyapatite, chitosan, and aliphatic polyester were also compounded using a twin-screw extruder. The polyesters used were the same applied in blends preparation. The mass fraction of chitosan ranged from 17.5 to 45%, while that of HA ranged from 10 to 30%. The tensile properties (tensile strength and tensile modulus), thermal properties, and morphological properties of the composites were evaluated. Ternary blends often lead to complex morphology and poor properties. The water absorption and degradation of the developed chitosan-based blends and composites were also evaluated, since these properties are critical for their possible applications as biomaterials. These studies revealed that chitosan content significantly affects the water uptake, weight loss and mechanical properties of the developed blends. The weight loss also directly correlates with the HA content being higher for higher HA amount present in the composite. Novel scaffolds made from chitosan-based blends and composites were produced by the melt-based routine involving compression molding and salt leaching. The scaffolds were made with different pore sizes and porosity, aiming at applications in bone and cartilage tissue engineering. Cytotoxicity evaluation were carried out using standard tests, revealing that L929 cells had comparable metabolic activities to that obtained for the negative control. Chitosan based fibers and chitosan fiber mesh scaffolds could also be prepared by melt processing (solvent-free) to be used as tissue engineering templates. Biological assessment was performed in direct contact assays, using a human osteosarcoma cell line (SaOs-2). Cells showed remarkable cell colonization, not only at the surface but also in the inner porous structure of the different scaffolds. Furthermore, the cells showed high indexes of viability in all the scaffold types. The motivation for this thesis was to develop and to produce a new range of chitosan based scaffolds using novel polymeric blends and composites in an established and reproducible melt processing technology. Most of the approaches reported in the literature to produce scaffolds from chitosan-based blends or composites involve the use of solvents, being this work the first that reports the successful use of a melt-based route. Moreover, the methodologies used are very versatile and avoid the drawbacks associated with solvents and allows for producing a large variety of scaffolds with a wide range of porosities and pore morphologies using different polymers.Um número cada vez maior de polímeros de origem natural tem sido utilizado em estratégias de engenharia de tecidos. Estes oferecem a vantagem de serem similares a substâncias macromoleculares, cujo sistema biológico está preparado para reconhecer e lidar metabolicamente. Outra característica interessante dos polímeros naturais é a possibilidade de serem degradados por enzimas existentes no organismo, levando a que o implante seja degradado e eventualmente metabolizado por mecanismos fisiológicos. O quitosano é um produto obtido pela desacetilação alcalina da quitina e tem similaridades estruturais com os glicosaminoglicanos, ou seja, mimetiza o seu comportamento funcional. Além disso, é descrito como sendo tipicamente não-tóxico, biodegradável e biocompatível. O quitosano exibe um espectro de propriedades que o tornam adequado para ser utilizado como alternativa aos biomateriais usados correntemente. Mas as suas propriedades mecânicas e processabilidade não são as ideais limitando a sua utilização em aplicações sujeitas a esforços elevados. É expectável que o desenvolvimento de materiais híbridos, combinando polímeros de origem natural com polímeros sintéticos biocompatíveis, minimize a incompatibilidade das propriedades mecânicas e preserve a sua biocompatibilidade funcional. Pouca ou nenhuma investigação tem sido desenvolvida focando o desenvolvimento de misturas de quitosano com poliésteres utilizado tecnologias baseadas na fusão. Uma vez identificada esta lacuna, os principais objectivos desta tese foram: i) produzir e determinar as propriedades de misturas e compósitos à base de quitosano com poliésteres alifáticos processados por tecnologias baseadas na fusão; ii) estudar as características de absorção de água e degradação das misturas e compósitos produzidos; iii) preparar scaffolds à base de quitosano com diferentes arquitecturas utilizando tecnologias baseadas na fusão; iv) avaliar o seu potencial comportamento citotóxico e conduzir ensaios de contacto directo com o objectivo de validar o potencial de serem utilizados em aplicações para engenharia de tecidos do osso ou cartilagem. O primeiro passo desta tese em termos de trabalho experimental consistiu em misturar, por técnicas de fusão, quitosano com policaprolactona (PCL), polibutileno succinato (PBS), polibutileno succinato coadipato (PBSA), polibutileno teraftalato co-adipato (PBTA) e poli (ácido láctico) (PLA). As quantidades de quitosano utilizadas na preparação das misturas de quitosano/PBS variaram entre 25% e 70% em peso. Aos restantes poliésteres foi adicionado 50% em peso de quitosano. As propriedades térmicas e mecânicas e respectiva morfologia das misturas produzidas foram avaliadas. Compósitos contendo hidroxiapatite (HA), quitosano e poliéster alifático foram preparados utilizando uma extrusora duplo fuso. Os poliésteres utilizados foram os mesmos das misturas anteriormente preparadas. A fracção mássica do quitosano variou entre 17.5% e 45%, enquanto a da HA variou entre 10% e 30%. As propriedades mecânicas à tracção, propriedades térmicas, e propriedades morfologias dos compósitos foram determinadas. As misturas ternárias apresentaram uma morfologia complexa e propriedades mecânicas abaixo do previsto. O comportamento em termos de absorção de água e degradação das misturas e compósitos à base de quitosano foi determinado uma vez que estas propriedades são criticas na utilização de biomateriais. Estes estudos revelaram que a quantidade de quitosano utilizado afectou significativamente a absorção de água, perda de peso e propriedades mecânicas das misturas produzidas. O perda de peso apresentou também uma relação directa com a quantidade de HA sendo maior nos compósitos preparados com maior quantidade de HA. Foram produzidos scaffolds com as misturas e compósitos à base de quitosano utilizando métodos baseados na fusão, nomeadamente moldação por compressão com lixiviação de sal. Os scaffolds foram produzidos com diferentes porosidades e diferentes tamanhos de poros com o objectivo de serem utilizados em estratégias de engenharia de tecidos do osso ou cartilagem. Foram realizados ensaios de citotoxicidade usando testes padrão, tendo as células L929 apresentado uma actividade celular semelhante à do controlo negativo. Fibras e scaffolds, à base de fibras, foram também desenvolvidas por tecnologias baseadas na fusão (sem solventes) para serem utilizados em estratégias de engenharia de tecidos. Foram realizados ensaios biológicos de contacto directo utilizando uma linha celular derivada de osteosarcoma humano (SaOs-2). As células apresentaram uma colonização notável, não apenas na superfície mas também no interior dos scaffolds. Além disso, as células apresentaram altos índices de viabilidade celular em todo o tipo de scaffolds. A motivação desta tese foi o desenvolvimento e produção de um novo tipo de scaffolds à base de quitosano utilizando novas misturas e compósitos com recurso a tecnologias baseadas na fusão. A maior parte das estratégias descritas na literatura para produção de scaffolds à base de quitosano envolve o uso de solventes, sendo este o primeiro trabalho que descreve o uso com sucesso de tecnologias apenas baseadas na fusão. Além disso, as metodologias usadas demonstraram ser muito versáteis evitando as desvantagens normalmente associadas aos solventes e permitiram a produção de scaffolds uma variabilidade alargada de porosidades e morfologia de poros.Portuguese Foundation for Science and Technology for the financial support through a PhD grant (SFRH/BD/22455/2005)EU project GENOSTEM (LSHB-CT-2003-503161