Estudos funcionais para determinação da patogenicidade de novas mutações no gene LDLR:diagnóstico e caracterização molecular da hipercolesterolemia familiar

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), 2007, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO receptor das lipoproteínas de baixa densidade (LDLR) é uma glicoproteína membranar que liga e internaliza colesterol associado às LDL. Mutações no gene LDLR cusam hipercolesterolemia familiar (FH), que resulta num catabolismo deficiente das LDL e elevação do colesterol, que se acumula nos tendões e artérias levando ao desenvolvimento prematuro de aterosclerose e doença cardiovascular. Foram estudadas 6 mutações missense no LDLR encontradas no decorrer do Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar , responsáveis pelas variantes G248R, V408L, W469R, S627P, P664S e V838M desta proteína, de forma a avaliar a sua patogenicidade. As diferentes variantes do LDLR foram obtidas por mutagénese dirigida e expressas em células CHO-ldlA7, sem expressão endógena do LDLR. Para analisar o efeito destas alterações, foram determinadas as taxas de uptake (ligação e internalização) e degradação de 125I-LDL e analisados os níveis de LDLR à superfície das células transfectadas, por imunocitoquímica. Todas as variantes do LDLR produziam a proteína madura, à excepção da W469R que acumulava a forma precursora do receptor. As células que expressavam as construções W469R e V408L apresentaram níveis muito baixos de actividade do LDLR e níveis de proteína à superfície igualmente reduzidos. A variante G248R apresentava cerca de 40% da actividade normal do receptor das LDL, com níveis normais de proteína à superfície. As variantes S627P e P664S mostraram reter ~40% e 60% de actividade, respectivamente. A variante V838M mostrou uma actividade comparável à do LDLR normal. Os resultados obtidos sugerem que a alteração V838M será uma variante silenciosa (polimorfismo) e as restantes 5 alterações serão a mutação causadora de doença em indivíduos portadores das mesmas. O fenótipo do caso-índex com a mutação V408L não está em concordância com a severidade do efeito desta mutação na actividade do LDLR, sugerindo a modulação do fenótipo por outros factores genéticos e/ou ambientaisThe low density lipoprotein receptor (LDLR) is a surface glycoprotein that mediates binding and uptake of cholesterol-rich lipoproteins from plasma, in particular LDL. Mutations in the LDLR gene cause familial hypercholesterolaemia (FH), which results in defective catabolism of LDL leading to premature atherosclerosis and coronary heart disease (CHD). Six missense mutations found in the LDLR gene during the Portuguese FH Study , responsible for protein variants G248R, V408L, W469R, S627P, P664S and V838M, were studied in order to assess their pathogenicity. The different LDLR mutants were generated by site-directed mutagenesis and expressed in CHO ldlA7 cells lacking endogenous expression of LDLR. To determine the effects of mutations on LDLR function we measured saturable binding plus internalization and degradation of 125I-labelled LDL at 37ºC and mature LDLR at cell surface by immunocytochemistry. All mutant constructs resulted in production of a detectable mature protein in CHO-A7 cells, except variant W469R which accumulated the precursor form. Variants W469R and V408L were severely impaired in their ability to mediate uptake and degradation of 125ILDL and showed reduced amounts of LDLR at cell surface. Variant G248R showed reduced LDLR activity (~40% of normal LDLR) despite normal levels of LDLR at cell surface. Variant S627P retained ~40% and variant P664S ~60% of normal LDLR activity. V838M cells showed essentially the same activity as cells expressing wild-type LDLR. Results suggest that five of the variants studied are the mutations causing disease in patients carrying those alterations and V838M is a rare non-pathogenic variant. The severe effect that the V408L mutation has in LDLR function does not correlate with the phenotype of the patient, suggesting other genetic or/ and environmental factors may be involved in phenotype modulatio