Recombinaison chez un réplicon eucaryote : implication d'éléments régulateurs de la transcription

La recombinaison homologue a été étudiée dans la cellule de souris à l'aide du modèle Rml. Rml est une molécule d'ADN circulaire hybride Py/souris comportant 1,03 copie du génome Py et une insertion (Ins) de 1628 pb d'ADN de souris. De part et d'autre de Ins, on retrouve une répétition virale directe de 182 pb, appelée répétition S. Rml, lorsque transfecté dans des cellules de souris, se convertit très efficacement en ADN Py de longueur unitaire par recombinaison entre les répétitions S (recombinaison S ou SR). La transfection de mutants de Rml, ayant une délétion ou une substitution de certains éléments régulateurs de la transcription précoce, comme la boîte TATA, a mis en évidence une relation étroite entre la capacité des molécules à se répliquer dans les 3T6 - donc à exprimer les protéines précoces - et leur capacité à recombiner. Nous avons donc proposé un modèle où la recombinaison SR est dépendante de la transcription précoce chez Rml. Toutefois, la transfection de mutants de Rml, handicapés au niveau de la transcription tardive et affectés également au niveau de la recombinaison, nous a amenés à modifier notre modèle, en ce sens où la recombinaison SR, chez Rml, semble influencée par les transcriptions virales précoce et tardive. L'implication d'éléments régulateurs de la transcription a également été mise en évidence chez des réplicons dérivés de Rml portant non pas une, mais deux régions intergéniques régulatrices des transcriptions précoce et tardive, la seconde région étant introduite au niveau de ITns. La transfection de ces molécules a permis de mettre en évidence deux types d'événements: la recombinaison SR, ayant lieu entre les deux répétitions S, et la recombinaison LR, ayant lieu entre les deux régions intergéniques. En ce qui concerne la SR, la détection de certains produits de recombinaison semble associée à la présence d'une séquence ayant un effet stimulateur sur la transcription tardive (fragment BamHI-BclI). De même, pour la LR, l'intégrité du promoteur tardif semble affecter la nature des produits générés par recombinaison. Enfin, l'analyse directe des transcrits chez des dérivés de Rml n'a pas permis de mettre en évidence un lien flagrant entre transcription et recombinaison. En effet, des mutants précoces de Rml, ayant apparemment une transcription précoce et une transcription tardive normales, ne recombinent pas ou recombinent très peu par rapport à la molécule sauvage. Toutefois, la méthode utilisée pour analyser la transcription des molécules, le RT-PCR, est une technique qualitative qui ne peut vérifier tous les aspects du processus transcriptionnel. Le travail présenté ici a éclairci deux points: 1) mise en évidence d'une dépendance de la recombinaison envers certains éléments régulateurs de la transcription; 2) démonstration de l'absence d'un lien direct entre recombinaison et processivité de la transcription. De plus, des expériences de co-transfection, visant en premier lieu à étudier l'implication de la protéine virale précoce grand T (LT) dans la recombinaison, ont permis de mettre en évidence un phénomène de recombinaison intermoléculaire nouveau, menant à la production d'ADN viral de longueur unitaire à partir d'un recombinant plasmidique