The use of integrative approaches to characterize new mechanisms of toxicity of pollutants in the aquatic environment

Anthropogenic pollution represents a major concern for aquatic ecosystem, which has been affected by a complex cocktail of heterogeneous compounds that may provoke significant toxic effects to the living organisms. Among the available techniques to assess effects, a combined use of chemical analyses and biological responses (biochemical, physiological and molecular) is a sound procedure for detecting impact of anthropogenic contaminants in freshwater systems. The overall goal of this thesis is the characterization of novel mechanisms of toxicity of contaminants present in the aquatic ecosystem both in the field and in the laboratory. In chapter 2, a comparative study in three rivers of Spain was performed, combining genetic, biochemical and individual biomarkers in Daphnia magna across 12 sampling sites. After in-situ exposure, gene transcription of 13 genes, feeding rates and enzymatic responses in the field were assessed and compared with those obtained in re-constituted water treatments, spiked with organic extracts obtained from water samples collected at the same locations and sampling periods. Up to 166 trace contaminants were detected in water and biodiversity and species richness were also evaluated. Both physio-chemical water parameters and transcription patterns corroborate phenotypic responses, differentiating sites within and across river basins. Overall, this work allowed to test the usefulness of using transcriptomic responses of D. magna genes in the detection and identification of different types of environmental stressors in the field in transplanted organisms. In chapter 3 and 4, it was developed a study of forensic ecotoxicology to unravel the major toxic components in a superfund site in Ebro River (Spain) during an unusual period of prolonged flushing flows. Post-exposure feeding rates of Daphnia magna were used to assess toxic effects of water samples. Organochlorine content of suspended material was analysed (SPE and GC¿MS/MS) and presence of mercury was also determined. Unexpectedly, observed toxic effects did not correspond to the analysed contaminants and were greater upstream the superfund site than downstream. In order to test other possible sources of toxicity i.e. toxins produced by cyanobacteria present upstream, a new LC-MS/MS method for fast determination of five toxins in suspended material and sediment samples was developed. Results allowed the detection of anatoxin-a and okadaic acid in suspended solids and sediment from Ebro River and its Delta. The residue levels of the cyanotoxin anatoxin-a were correlated with observed feeding inhibition responses and confirmed in the lab using anatoxin-a produced from Planktothrix agardhii, a filamentous cyanobacteria. In chapter 5, a study of water quality in a Spanish natural reserve (Tabla de Daimiel, TDNP) was implemented. We sampled 12 locations during 2013 and performed a series of in-vivo (Daphnia magna post-exposure feeding inhibition) and in-vitro bioassays (dioxin-like and estrogenic recombinant yeast assays). Toxicity results were compared with the chemical analysis of PAHs (GC-MS/MS) and estrogenic compounds (LC-MS/MS). Results showed a current good chemical status of TDNP, but threatened by both the inflow of wastewater treatment plants effluents from its river tributaries and by direct sewage discharges, as it occurs in the Navaseca Pond. In chapter 6, D. magna was exposed to selected neuro-active pharmaceuticals (carbamazepine, diazepam, propranolol, fluoxetine) at low environmentally relevant concentrations (ηg to few µg/L). The first three tested pharmaceuticals were able to enhance reproduction at 1 µg/L, 0.1 µg/L and 1 ηg/L,, respectively. Moreover, fluoxetine, carbamazepine and diazepam increased positive phototactic behavior at concentrations ranging from 1, 10 and 100 ηg/L, respectively.La contaminación antropogénica afecta gravemente los ecosistemas acuáticos, encontrando en estos un coctel complejo de compuestos capaces de provocar graves efectos tóxicos a los organismos expuestos. En esta tesis se presentan varias técnicas que combinan el análisis químico con el estudio de respuestas biológicas para estudiar eficazmente el impacto de la polución antropogénica en los sistemas de agua dulce. El objetivo general es caracterizar nuevos mecanismos de toxicidad de contaminantes presentes en ecosistemas acuáticos tanto en el campo como en el laboratorio. En el Capítulo 2 se realizó un estudio comparativo de tres cuencas fluviales españolas realizando exposiciones in situ en 12 puntos diferentes con Daphnia magna. Tras la exposición, se evaluaron los cambios en transcripción génica de 13 genes, tasa de alimentación y en varias respuestas enzimáticas. De esos mismos puntos, se analizó el contenido en contaminantes del agua y se evaluó en grado de biodiversidad. Tanto los parámetros físico-químicos del agua como los patrones de trascripción corroboraron las respuestas fenotípicas observadas, diferenciando tanto los puntos de exposición como las cuencas. Con este trabajo se demuestra la utilidad de analizar variaciones en la respuesta transcriptómica de D. magna para detectar e identificar distintos factores de estrés ambiental en estudios de campo. En los capítulos 3 y 4 se desarrolló un estudio de ecotoxicología forense para desenmascarar los componentes más tóxicos en una zona altamente contaminada del rio Ebro (España) durante un inusual período de crecidas de dicho rio. Los posibles efectos tóxicos del agua muestreada se evaluaron analizando los cambios en la tasa de alimentación de D. magna. Se determinó el contenido en organoclorados del material en suspensión (SPE y GC-MS/MS) y la presencia de mercurio. Los resultados indicaron que los efectos tóxicos no se debían a los contaminantes analizados y que eran mayores aguas arriba de la zona de muestreo. Considerando posible que la toxicidad fuera debida a la presencia de toxinas producidas por cianobacterias, se desarrolló un nuevo método de LC-MS/MS para la detección de cinco toxinas. Los resultados permitieron detectar la presencia de anatoxina-a y ácido okadáico en los sólidos en suspensión y sedimentos del rio Ebro y de las lagunas de su delta. Los niveles de anatoxina-a se correlacionaron con la inhibición de la ingesta, y se confirmó en el laboratorio empleando anatoxina-a producida por Planktothrix agardhii, una cianobacteria filamentosa. En el capítulo 5 se realizó un estudio de calidad del agua en las Tablas de Daimiel (TDNP) y en sus lagunas asociadas. Durante 2013 se tomaron muestras en 12 localizaciones diferentes y se realizaron ensayos in vivo (inhibición de la ingesta en Daphnia magna) e in vitro (actividad estrogénica o tipo dioxina en levaduras recombinantes, ensayo RYA). Los resultados de toxicidad se compararon con el análisis químico de PAHs (GC-MS/MS) y de compuestos estrógenicos (LC-MS/MS). Los resultados mostraron que TDNP se encuentra en buen estado químico, pero está amenazado por el flujo procedente de plantas de tratamiento de aguas residuales, que vierten en los ríos que alimentan a TDNP, y por vertido directo de aguas de alcantarillado, como sucede en el estanque de Navaseca. En el capítulo 6 se expuso D.magna a fármacos neuroactivos de distintas familias (carbamacepina, diazepam, propranolol y fluoxetina) y a concentraciones bajas, pero relevantes en el medioambiente (de ηg/ul a pocos µg/L). Los tres primeros provocaron un aumento en la tasa de reproducción a concentraciones de 1 ηg/L (propranolol), 0.1 µg/L (diazepam) y 1 µg/L (carbamacepina). Además, fluoxetina, carbamacepina y diazepam aumentaron el comportamiento fototáctico positivo en concentraciones de 1, 10 y 100 ηg/L, respectivamente