Modulação colinérgica da secreção de insulina em ilhotas de ratos alimentados com dieta hipoprotéica

Orientador: Everardo Magalhaes CarneiroDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Sabe-se que 50% da insulina secretada no periodo pós-prandial imediato depende da estimulação colinérgica e que no diabetes tipo 2, a fase rápida da secreção de insulina é a primeira a desaparecer. Ilhotas de ratos desnutridos também apresentam perfil de secreção de insulina sem o padrão bifásico. Até o momento, pouco se sabe a respeito da regulação autonômica, especialmente da modulação colinérgica da secreção de insulina, em ilhotas de Langerhans de ratos submetidos à restrição protéica. Assim, o presente projeto tem como objetivo estudar o efeito da restrição protéica sobre a modulação colinérgica da secreção de insulina em ilhotas isoladas de ratos. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais, um grupo controle tratado com dieta normoprotéica (NP) (17%) e outro grupo desnutrido tratado com dieta hipoprotéica (LP) (6%). Após dois meses de desnutrição os animais foram sacrificados para o início dos experimentos. Nossos resultados indicaram que a dieta hipoprotéica induz uma diminuição na massa corpórea dos animais. A albuminemia está diminuída no grupo tratado com dieta hipoprotéica. O grupo LP mostrou níveis de ácidos graxos livres aumentados no plasma e redução dos níveis de proteínas totais em relação ao grupo NP, caracterizando o quadro de desnutrição. A insulinemia está reduzida nos animais LP e a glicemia mantida, sugerindo uma maior sensibilidade dos animais LP ao hormônio. A resposta secretória de insulina pelas ilhotas LP foi menor que a resposta secretória das ilhotas NP, quando estimuladas com o agonista muscarinico carbacol (CCh) e o forbol éster (PMA) em presença glicose (G). A curva dose resposta para o carbacol mostrou que as ilhotas de ratos submetidos a restrição protéica são menos sensíveis que as ilhotas dos animais controle (LP Ecso= 4.64:t0.98 e NP Ecso= 2.15:tO.70 (p<0.05)). Quando as ilhotas foram estimuladas com PMA (200"M) the increased in insulin secretion was higher in NP islets (3.04 fold for 8.3 mM ofG and 1.50 fold for 16.7 mM of G) (p<0.05). A monitoração do efluxo de cálcio mostrou um maior efluxo de cálcio nas ilhotas de animais LP estimuladas com CCh e PMA em presença de glicose. A técnica de imunohistoquímica, mostrou uma diminuição na quantidade da proteína quinase C alfa (pKCa) que foi confirmada utilizando-se a técnica de Western Blotting, onde encontramos PKCa e fosfolipase C betal (PLC_I) diminuídas em ilhotas isoladas de ratos LP (p<0.05). o RT -PCR mostrou uma diminuição na quantidade de mRNA para a enzima PKCa, o que nos sugeriu uma possível relação entre a restrição protéica a qual o animal foi submetido e alterações na transcrição de genes que codificam enzimas relacionadas com o processo secretório estimulado com glicose e potencializadas com CCh. Até o momento podemos concluir que, a alteração no conteúdo destas enzimas neste modelo experimental permite explicar, pelo menos em parte, a pobre resposta secretória encontrada frente a G, e a associação de CCh e PMA. Mais ainda, a restrição protéica efetuada no período pós desmame poderia estar induzindo modificações importantes em enzimas envolvidas com a transdução de sinais no sistema colinérgico da ilhota, repercutindo na fase adulta do animal.Abstract: We studied the effects of carbamy1choline (CCh) and Phorbol 12-Myristate 13 Acetate (PMA), in insulin secretion of isolated Largerhans islets of male Wistar rats maintained with normal protein diet (17% of protein =NP) or low protein diet (6% of protein =LP). Islets isolated by collagenase digestion of pancreata, were incubated (lh) in Krebs medium with 8.3 mM or 16.7 mM of glucose (G), with or without CCh and PMA. The insulin content of media was available by radioimunoassay. Concentrations of CCh (O, l-I 000 j..lM) increased insulin secretion in both groups. Stimulation with CCh shifted the LP dose-response curve to the right (LP Ecso = 4.64:tO,98 and NP Ecso = 2.15 0,70) (p<0,05). When the islets were stimulated with PMA (20011M) the increased in insulin secretion was higher Ín NP islets (3.04 fold for 8.3 mM ofG and 1.50 fold for 16.7 mM of G) (p<0.05). Immunocitoquemical showed a decrease in PKCa content in LP islets and Western blot analysis revealed that PKCa and PLCf31 expression in LP isolated rat islets, after 2.5 h of incubation in 8.3 mM glucose media, were lower than NP (p<0.05) and RTPCR showed a decrease in rnRNA levels to PKCa (p