Estudo de alguns mecanismos de regulação osmótica e da expressão da glutamina sintetase em células de Helianthus annuus L. sujeitas a stress salino

O aproveitamento de solos e águas com elevado teor em NaCl passa pelo entendimento do efeito deste sal no metabolismo das células vegetais, sobretudo ao nível da regulação osmótica, e pela selecção de genótipos tolerantes a sal. As culturas in vitro .têm vindo a desempenhar um papel determinante na caracterização e selecção de células adaptadas a "stress" salino: O girassol é uma oleaginosa de elevado interesse económico sendo cultivada, por tradição, em solos que, frequentemente, apresentam problemas de dessecação ou de excesso salino, pelo que se toma necessário caracterizar esta espécie relativamente à tolerância salina e estudar a possibilidade de seleccionar in vitro células adaptadas. O estudo efectuado durante esie trabalho teve por objectivo, numa primeira fase, estabelecer um método eficaz de regeneração in vitro de plantas de girassol a partir de tecido caloso e por regeneração de protoplastos. Das diferentes condições ensaiadas a melhor resposta ocorreu a partir de cotilédones de plântulas com 4-7 dias de idade, em meio MS modificado (MSmod2) e suplementado com NAA (0,5 mg.dm-3), BA (0,5mg.dm-3) e GA3 (0,l mg.dm-3). A indução de porções aéreas e posterior regeneração de plantas foi obtida por transferência para meio MSmod2 com NAA (0,lmg.dm-3), BA (1,O mg.dm-3) e GA3 (0,l mg.dm-3) e posteriormente com NAA (1,O mg.dm-3), BA (0,lmg.dm-3) e GA3 (0,l mg.dm-3). Para o isolamento de protoplastos usaram-se cotilédones, hipocótilos e calli como fonte de material. Ensaiaram-se diferentes condições de isolamento (composição salina, combinação de enzimas e tempo de digestão). A melhor produção de protoplastos foi obtida com hipocótilo em meio de digestão salino tamponado e com Cellulase Onozuka (0,2%), Macerozyme Onozuka (0,2%) e Driselase Fluka (0,2%) ao fim de 12 horas de digestão. A produção média de protoplastos variou, nestas condições, entre (3,2x105 e 9,8x105 protoplastos.gpf-l para, respectivamente, callus e hipocótilo). A cultura de protoplastos em meio líquido L4M e V-KM conduziu a uma taxa de divisão muito baixa acabando as células por morrer. A formação de microcalli ocorreu em meio sólido L4M1 imbebido em meio líquido ~4~O1s .ca lli proliferaram quando transferidos para meio sólido MSmod2 e regeneraram porções aéreas que desenvolveram raízes quando transferidas para o mesmo meio com as combinações de fitorreguladores adequadas. Numa segunda fase, os calli e plantas em cultura hidropónica, foram sujeitos a concentrações crescentes de NaCI (0, 50, 100, 200 e 300 mM de NaCI) assim como a PEG 6000 (50 g.dm-31, KCI 100 mM e Na2S04 50 mM. Os calli mostraram maior tolerância a NaCI do que as plantas. O valor estimado de ID50 para os calli situa-se nos 183 mM de NaCl enquanto nas plantas se situa nos 66 mM de NaC1. Concentrações de 200 e 300 mM de NaCl revelaram-se letais para as plantas e calli. A imposição de "stress" osmótico teve um efeito menos drástico nas plantas e calli do que qualquer dos tratamentos salinos, enquanto o "stress" com Na2S04 levou à necrose das plantas um mês após a cultura. O "stress" de NaCl induziu aumentos dos conteúdos de Na e C1- em toda a planta diminuindo os de nitrato, sulfato e potássio. Os níveis de Ca e Mg foram apenas afectados na porção aérea, enquanto o conteúdo de fosfato não foi afectado. Nos calli apenas os níveis de nitrato, sulfato, potássio e cálcio foram negativamente afectados, subindo os de Na e CI-. A exposição a "stress" salino e osmótico incrementou os conteúdos de açúcares redutores, sacarose e de aminoácidos totais. Destes destaca-se a Pro, Asp e Ser nas plantas expostas a "stress" osmótico e salino, enquanto nos calli aumentaram os níveis de Pro, Ser, Ala, Arg e Val. Células tolerantes a 200 mM e 300 mM mostraram padrões de variação dos aminoácidos ligeiramente diferentes, com um incrementos de níveis de prolina, serina, e ácido glutâmico (HA3), e um maior incremento dos níveis de açúcares.The use of saline soils and water in agriculture implies the study of the effects of NaCl on plant cell metabolism (with particular emphasis on osmotic regulation) and the selection of salt tolerant genotypes. In vitro cultures play an important role on the characterisation of cells under salt stress and on the selection of salt tolerant cells. Sunflower is an important oil crop and is frequently grown on arid and saline soils. Therefore it is important to characterise-the salt tolerance of this species and to evaluate the possibility of selecting in vitro salt tolerant genotypes. The first aim of this study was the establishment of in vitro conditions for plant regeneration by calli organogenesis and protoplast regeneration. Cotyledons from young seedlings grown on modified MS medium (MSmod2) supplemented with NAA 0,5 mg.dm-3, BA 0,5 mg.dm-3 and GA3 0,l mg.dm-3 gave the best calli proliferation with shoot development (NAA 0,lrng.dm-3, BA 1,O mg.dm-3 and GA3 0,l mg.dm-3) and further rooting (NAA 1,O mg.dm-3, BA 0,1 mg-dm-3 and GA3 0,I mg.dm-3). Protoplasts were isolated from cotyledons, hypocotyls and calli. Different isolation conditions were assayed and the best results were achieved with hypocotyls after 12 h of digestion in a salted buffered medium with Cellulase Onozuka (0,2%), Macerozyme Onozuka (0,2%) and Driselase Fluka (0,2%). Under these conditions the production of protoplasts varied between 3,2x105 and 9,8x 105 protoplasts per gram of fresh tissue. Solid L4M1 medium surrounded by liquid medium gave the best results for colony formation. Calli proliferation and plant development was succeeded on MSmod2 medium supplemented with the appropriate growth regulators (see above). In the second part of this work calli and plants were exposed directly to high concentrations of NaCl (0, 50, 100,200 and 300 mM), to PEG 6000 50g.dm-3 and to KC1 100 mM and Na2S04 50 mM. Salinity decreased plant and calli growth, with plants presenting an ID50 of 66 mM NaCl whereas th-e calli', more tolerant, had an ID50 of 183 mM NaCl. Concentrations of NaCl 200 mM and 300 mM were lethal to plants and to calli when exposed directly to stress. NaCl stress increased Na and C1- contents in plants but decreased the levels of nitrate, sulphate and potassium, whereas the contents of Ca and Mg decreased only in the shoot. Calli exposed to NaCl stress suffered also an increase in Na and C1- content, and a decrease in Ca, K, sulphate and nitrate levels. PEG stress was less drastic to plants and calli than severe salt stresses, whereas Na2S04 lead to the death of plants and calli after 4 weeks of culture. Apart from Na2S04, all other stress conditions lead to an increase in sugar (mainly sucrose than reducing sugars),and aminoacid contents. Proline suffered the highest increase in all tissues and conditions. Also Asp and Ser suffered an increase in plants exposed to NaCl, PEG and KCI, and Ser, Ala, Arg and Val increased in calli exposed to NaCI, PEG and KC1 stresses. Calli tolerant to 200 and 300 mM NaCl showed different patterns of variation in aminoacids and micronutrients, with an increase in glutamic acid 'levels (HA3) and a higher increase in sugar contents.Programa Doutoral em Biologi