Optimization of methods for isolation and analysis of lipid rafts from Atlantic cod (Gadus morhua) intestinal enterocytes, with alkaline phosphatase as a focus point

Himnuflekar eru þétt pökkuð svæði innan frumuhimnunnar, rík af kólesteróli og glýkósphingólípíðum. Rannsóknir á þeim hafa vaxið ört síðustu tvo áratugi, en samkvæmt okkar bestu vitund, hafa ekki verið framkvæmdar rannsóknir á himnuflekum úr burstalagi þarmaþekjufruma geislaugga fiska (Actionoerygii) fyrr. Alkalískur fosfatasi (AP) er vel þekkt merkiensím í burstahimnulagi (e. brush border membranes; BBM) og er staðbundið í himnuflekum. AP úr Atlantshafsþorski (Gadus morhua) hefur verið til rannsóknar á rannsóknarstofu okkar um langt skeið og því vaknaði áhugi okkar á að auðkenna prótein og lípíðsamsetningu slíkra himnufleka og freista þess að kasta ljósi á náttúrulegt hlutverk þess, sem er óþekkt. Fyrsta markmið okkar var að einangra og auðkenna BBM og himnufleka úr þarmaþekjufrumum Atlantshafsþorsks til að staðfesta tilvist þeirra og bera saman við rannsóknarniðurstöður frá öðum dýrategundum. Til að skilgreina einangrunarferlið, var notast við virknimælingar á þekktum merkiensímum hvers himnuhluta fyrir sig. Auk þess var dreifing AP kortlögð með mótefnavefjalitun og virknimælingu. Próteinmengjafræðilegar upplýsingar fengust með notkun massagreina (MALDI eða LC-ESI) á trypsinmeltum próteinsýnum sem höfðu áður verið aðgreind með SDS rafdrætti. Ólíkar aðferðir sem þörfnuðust bestunar sýndu allar aukningu í magni AP, bæði í BBM hluta og himnuflekum. Einnig voru framkvæmdar 31P-NMR mælingar á fosfólípuðum sem gefa hlutfallslegt magn allra fosfólípíða. Þær mælingar gáfu upplýsingar um hátt fosfatidylkólinhlutfall í BBM, en hins vegar hátt hlutfall sphingólmýelíns í himnuflekum. Kólesterólmælingar sýndu hátt hlutfall í himnuflekum m.v. sápuleysanlega hluta BBM himnunnar. Þannig sýndu allar þessar mælingar öll þekkt einkenni himnufleka, borið saman við aðrar dýrategundir. Nokkur prótein hafa þegar verið auðkennd í himnuflekunum s.s. amínópeptíðasi N, beta actin og villin 2. Þannig hefur tilvist þekktra himnuflekapróteina og frymisgrindarpróteina verið staðfest í himnuflekum úr burstalagi þarmaþekjufrumna Atlantshafsþorsks (Gadus morhua), sem er af ættkvísl geislaugga (e. ray-finned fishes). Það hefur ekki verið áður gert, eftir því sem við best vitum, fyrir þann stóra hóp fisktegunda