Development of novel strains for the production of biofuels

Tese de Doutoramento em BioengenhariaButanol is a four-carbon alcohol with a wide range of applications, which include: solvent for paints, dyes and resins; precursor of several polymers; and flavoring agent in food and beverage industry. Recently, the potential use of butanol as a biofuel has gained attention due to its superior properties when compared with the mostly used biofuel – ethanol. Butanol is natively produced by strains from genus Clostridium via Acetone-Butanol-Ethanol fermentation, a challenging industrial process. In this regard, more robust microorganisms have been tested as butanol producers. This thesis addresses the construction of novel strains of Escherichia coli to produce butanol. Firstly, a novel route to produce butanol was selected from pathways previously generated using a hyper-graph algorithm. To do so, the pathways were ranked according to diverse criteria such as butanol yield, thermodynamic feasibility and number of reactions. Then, the most promising pathways were integrated into iJO1366, the most comprehensive E. coli genome-scale metabolic model available. The application of computational tools allowed to search for sets of genetic modifications that maximized product excretion. In this novel pathway, 2-oxoglutarate is converted into butanol in seven catalytic steps by enzymes from different microbial sources. This pathway was validated in vivo by expressing nine heterologous genes in E. coli distributed in three plasmids. The developed strains were able to excrete butanol (maximum titer of 128.96±7.74 mg.L-1), representing the first reported butanol production using 2- oxoglutarate as precursor. Then, to implement an in silico suggested engineering strategy, the main mixed-acid fermentation pathways were inactivated to force the use butanol production as a NADH recycling route. Although butanol production could not be improved by removing the competing pathways, ethanol production was abolished, and lactate/acetate accumulation was reduced. Lastly, strains of E. coli able to produce butanol through clostridial pathway were engineered by testing alternative enzymes to catalyze two rate-limiting steps. For the first step of this pathway, the native thiolase was replaced by the gene phbA from Cupriavidus necator. The clostridial gene bcdetfAB and ter from Treponoema denticola were both tested. Moreover, the effect of using a single or an individual promoter to express the genes constituting the BCS (butyryl-CoA synthesis) operon was explored. The maximum butanol titer was 58.41±2.88 mg.L-1. These constructions also allowed to conclude about the differences between the clostridial pathway and the newly designed pathway in terms of nutrient requirements and performance in different strain backgrounds. The novel pathway, as opposed to the clostridial one, has a better performance in defined medium and in E. coli K strains.O butanol é um álcool de quatro carbonos com diversas aplicações, tais como: solvente na produção de tintas, corantes e resinas; precursor de vários polímeros e agente aromatizante na indústria alimentar e de bebidas. Mais recentemente, o potencial do butanol como biocombustível destacouse devido às suas características superiores quando comparado com o biocombustível mais usado: etanol. O butanol é produzido nativamente por várias estirpes do género Clostridium pela fermentação Acetona-Butanol-Etanol, um processo difícil de implementar industrialmente. Por esse motivo, outros microrganismos mais robustos têm sido testados como produtores de butanol. Esta tese visa a construção de novas estirpes de Escherichia coli para produzir butanol. Inicialmente, uma nova via alternativa à de Clostridium foi selecionada de entre as diversas vias geradas por um algoritmo de híper-grafos. Nesse sentido, as vias foram classificadas de acordo com diversos critérios, tais como rendimento em butanol, viabilidade termodinâmica e número de reações. Posteriormente, a via considerada como a mais promissora foi integrada num modelo metabólico à escala genómica de E. coli, iJO1366, o que permitiu a aplicação de ferramentas computacionais para procurar conjuntos de modificações genéticas que maximizam a produção de butanol. Nesta nova via, o 2-oxoglutarato é convertido em butanol através de sete reações catalisadas por enzimas de várias fontes microbianas. Esta via foi validada in vivo através da inserção de nove genes heterólogos em E. coli, distribuídos por três plasmídeos. As estirpes construídas foram capazes de produzir butanol (concentração máxima de 128.96±7.74 mg.L-1), provando pela primeira vez que butanol pode ser produzido usando 2-oxoglutarato como precursor. De seguida, as principais vias fermentativas de E. coli foram apagadas de forma a testar um genótipo ótimo obtido in silico. Apesar da produção de butanol não ter aumentado, observou-se a abolição da produção de etanol e uma diminuição na acumulação de acetato e lactato. Por último, a via de Clostridium foi manipulada em dois passos identificados como limitantes. No primeiro passo, a tiolase foi substituída pelo gene phbA de Cupriavidus necator, enquanto que os genes bcd-etfAB e ter de Cupriavidus necator foram ambos testados. Adicionalmente, o efeito de expressar os genes do operão BCS (síntese de butiril-CoA) num promotor único ou individual foi explorado. A produção máxima de butanol obtida nas estirpes de E. coli resultantes foi 58.41±2.88 mg.L-1.. Estas construções também permitiram aferir as diferenças entre a via de Clostridium (e seus derivados) e a nova via em termos de requerimentos nutricionais e desempenho atendendo à estirpe utilizada. A nova via, em oposição à de Clostridium mostrou um melhor desempenho em meio definido e usando a estipe de E. coli K