Structural and fonctional analysis of humain nhej pathway multiprotein complexes

La voie de réparation NHEJ (Non-Homologous End-Joining) est une voie majeure de réparation des cassures double-brin chez l’homme. Les protéines de cette voie interagissent et forment des complexes dynamiques dont les mécanismes moléculaires sont encore largement méconnus. Nous avons dans un premier temps mis au point des protocoles de production à l’échelle de plusieurs milligrammes des protéines cœur de la voie NHEJ en cellules d’insecte à l’aide du système MultiBac. Nous avons ainsi purifié les complexes Ku70/Ku80 et Ligase4/XRCC4 et les protéines Cernunnos et Artemis à homogénéité. Des essais de cristallisation, des études par SAXS et des analyses par microscopie électronique ont été réalisés sur différents complexes formés par ces protéines cœur du NHEJ. Nous avons également caractérisé par chromatographie d’exclusion de taille et calorimétrie, les interactions effectuées entre les protéines de la voie NHEJ. L’ensemble de ces travaux a permis d’établir des bases biochimiques solides en vue des études structurales et fonctionnelles de la voie NHEJ chez l’homme.Human DNA repair pathway NHEJ (Non-Homologous End-Joining) is a major pathway of double-strand breaks repair. The proteins involved in this pathway interact and form dynamic complexes whose molecular mechanisms are largely unknown. Firstly, we established protocols to be able to purify milligrams of those NHEJ pathway core proteins using MultiBac insect cells system. We then purified Ku70/Ku80 and Ligase4/XRCC4 complexes, Artemis and Cernunnos to homogeneity. Crystallogenesis assays, SAXS experiments and Transmission Electronic Microscopy experiments have been performed on several complexes formed by these core NHEJ proteins. We also characterized the interactions between these proteins by Size Exclusion Chromatography and Isothermal Calorimetry. These experiments have led to biochemical results sufficient to establish a solid basis to initiate the structural and functional study of the Human NHEJ Pathway