Interactions of selected polyphenols with drugs and food contaminants

Polyphenole sind eine bedeutende Klasse von sekundären Pflanzenstoffen und vielen Substanzen aus dieser Klasse werden antioxidative und chemopräventive Wirkungen zugeschrieben. Während sich die Wissenschaft in den letzten Jahrzehnten intensiv mit diesen Effekten und den zugrundeliegenden Mechanismen beschäftig hat, wurde weit weniger in die Aufklärung der Frage investiert, inwieweit Polyphenole in der Lage sind, andere bioaktive Substanzen in ihrer Wirkung zu beeinflussen. Ein Bereich, in dem solche Wechselwirkungen von besonderer Signifikanz wären, ist die Chemotherapie. Nachdem ihr Ziel darin besteht, das Wachstum von Krebszellen zu unterbinden, wäre es unerwünscht, wenn Polyphenole diese beschützen würden. Umgekehrt wäre eine Verstärkung der medikamentösen Effekte durch natürliche Komponenten mit sehr geringen Nebenwirkungen von großem pharmazeutischen Wert. Außerdem wäre es denkbar, dass Polyphenole mit sehr geringer Bioverfügbarkeit, wie z.B. Anthocyane, den Gastrointestinaltrakt vor unerwünschten Nebenwirkungen der Chemotherapie schützen könnten, aufgrund ihrer Abwesenheit in den Zielorganen aber den therapeutischen Erfolg nicht schmälern würden. Eine interessante, junge Klasse von Chemotherapeutika wirkt über die Hemmung von Rezeptortyrosinkinasen (RTK), eine Familie von Rezeptoren, die vor allem für die Vermittlung von Wachstumssignalen eine bedeutende Rolle spielen. Eine der wichtigsten RTKs ist der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor („epidermal growth factor receptor“, EGFR), der in Tumorgewebe oft überexprimiert wird und dadurch zum Ziel für therapeutische Ansätze wurde. Ein prominentes Beispiel für einen EGFR-inhibierenden Wirkstoff ist Erlotinib (ERL), der bereits zur Behandlung von fortgeschrittenen Pankreas- sowie bestimmten Lungentumoren zugelassen wurde. Auch für einige Polyphenole, wie z.B. für das Isoflavon Genistein (GEN), das Anthocyanidin Delphinidin (DEL) bzw. für einen DEL enthaltenden Beerenextrakt wurde kürzlich eine Hemmung des EGFRs nachgewiesen. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit eventuelle Auswirkungen dieser Komponenten auf den zytostatischen Effekt von ERL an einer humanen Krebszelllinie untersucht. Auf der Ebene der Zellwachstumshemmung konnten mittels Sulforhodamin B (SRB) Assay antagonistische Wechselwirkungen eines Heidelbeerextrakts, dessen Hauptanthocyans DEL-3O-Glukosid, DELs sowie GENs auf die zytostatische Wirkung des Chemotherapeutikums nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte für GEN mittels SDS-PAGE/Western Blot als Mechanismus eine Beeinträchtigung der Fähigkeit ERLs, die Phosphorylierung des EGFRs zu unterdrücken, belegt werden. Eine weitere Gruppe von bioaktiven Substanzen, bei der Interaktionen mit Polyphenolen denkbar sind, sind Lebensmittelkontaminanten, wobei insbesondere Mykotoxine von großer Bedeutung sind. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, inwieweit Polyphenole in der Lage sein könnten, Zellen vor toxischen Auswirkungen von durch Alternaria spp. verursachten Kontaminationen zu schützen. Letztere bilden eine Gattung von ubiquitär verbreiteten Schimmelpilzen, die abhängig von den Wachstumsbedingungen eine große Anzahl verschiedener Mykotoxine produzieren. Besonders bedeutend ist Alternariol (AOH), 66 ein Toxin, das sowohl oxidativen Stress verursacht als auch als Gift der Topoisomerase II (Topo II), einem Enzym zur Regulation des Verdrillungsgrades der DNA, wirkt und dadurch DNA-Schäden verursacht. Polyphenole werden generell mit antioxidativen Eigenschaften in Verbindung gebracht, und einige Vertreter, z.B. DEL und GEN, sind darüber hinaus auch für die Inhibierung der Topo II bekannt. Für DEL wurden außerdem bereits antagonistische Wechselwirkungen mit chemotherapeutischen Topo II Hemmstoffen beschrieben. Daher wurde der Einfluss von DEL und GEN auf die Zyto- bzw. Genotoxizität von AOH in humanen Kolonkarzinomzellen untersucht. Während nur leichte Interaktionen auf der Ebene der Zytotoxizität feststellbar waren, wurden auf Ebene der DNA-Schädigung mittels Einzelzell- Gelelektrophorese („comet assay“) signifikante antagonistische Wechselwirkungen beider Polyphenole mit AOH festgestellt. Die mechanistische Aufklärung ergab einen antagonistischen Einfluss auf die Mykotoxin-induzierte Giftung der Topo II durch beide Flavonoide, sowie eine deutliche Verringerung des induzierten oxidativen Stresses durch DEL. Weiters wurde auch eine eventuell protektive Wirkung DELs gegenüber Altertoxin II (ATX-II), das kürzlich als hauptgenotoxische Komponente in einem Extrakt aus auf Reis kultivierten Alternaria alternata identifiziert wurde, untersucht. Hierbei war ein überraschend starker protektiver Effekt DELs auf Ebene der Gentoxizität zu beobachten. Beim Versuch einer mechanistischen Aufklärung dieses Effekts konnte mittels LC-MS gezeigt werden, dass eine simultane Inkubation mit DEL und/oder dessen Abbauprodukten signifikant verringerte ATXII Konzentrationen in wässrigen Lösungen zur Folge hat. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine direkte chemische Reaktion zwischen dem Polyphenol und dem Mykotoxin stattfindet, die zur Verringerung der Toxizität führt. Zusammenfassend demonstriert diese Doktorarbeit anhand ausgewählter Beispiele das hohe Potential von Polyphenolen, die Wirkung anderer bioaktiver Verbindungen zu beeinflussen. Die beobachteten Wechselwirkungen finden auf unterschiedlichen Ebenen statt. So konnte ein Einfluss der untersuchten Polyphenole auf die Zytotoxizität, die Genotoxizität, die RTKund Topo- Inhibierung, die Induktion von oxidativem Stress sowie auf die chemische Stabilität der anderen Testkomponenten beobachtet werden. Generell deuten die Daten darauf hin, dass Polyphenole meist einen antagonistischen, also abschwächenden Einfluss auf die Toxizität anderer Substanzen ausüben. Dieser Umstand ist im Falle von Lebensmittelkontaminanten sicherlich erfreulich, sollte jedoch mit Vorsicht bedacht werden, wenn die Kombination pharmazeutische Wirkstoffe und insbesondere Chemotherapeutika betrifft.In recent years much research was dedicated to the impact of bioactive food constituents on health and disease prevention. In particular, the class of polyphenols has been in the spotlight as many compounds were found to possess anti-oxidative and chemopreventive properties through a spectrum of different mechanisms. Yet until now, considerably less attention was given to the possibility that this compounds might interact with other bioactive agents like drugs or food contaminants. One field where such interactions could have a tremendous impact is chemotherapy, where the aim is to suppress the proliferation of cancer cells. If those were protected by food constituents this might negatively influence the outcome of the therapy. But also beneficial effects seem conceivable, as some polyphenols – for example anthocyanins - have a very low systemic bioavailability, limiting their site of action mostly to the gut. Here, they might hypothetically protect non-cancerous cells from severe side effects of drugs without interfering with the therapy targeting a different organ. One interesting new family of chemotherapeutic drugs is the class of receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors, which are preventing those receptors to engage in growth signalling. But also some polyphenols, for example the soy isoflavone genistein (GEN) or the berry anthocyanidin delphinidin (DEL), were previously described to inhibit RTKs, including the epidermal growth factor receptor (EGFR). Thus, in the frame of this thesis, in vitro experiments were conducted combining erlotinib (ERL), an EGFR inhibitor approved for the treatment of late stage lung and pancreatic cancer, with the latter polyphenols. The focus hereby lay on interactions at the level of cell growth inhibition by conducting SRB assays and of the inhibition of EGFR phosphorylation by SDSPAGE/ Western blot. GEN, a polyphenol-rich bilberry extract, its major anthocyanin delphinidin-3O-glucoside and the corresponding anthocyanidin DEL were observed to antagonistically influence cell growth inhibition by erlotinib. For GEN this effect could be related to an interference with EGFR inhibition, while for the other compounds a different mechanism has to be considered. But polyphenols might also alter the toxicity of food contaminants. For example, molds of the genus Alternaria are frequently found to contaminate different foods and produce a wide range of different mycotoxins, of which some have been found to be genotoxic. Alternariol (AOH) was recently described to act both as an inducer of oxidative stress and as a poison of topoisomerase II (Topo II), an enzyme crucial for maintaining DNA integrity, and thus to induce DNA damage. Additionally, both GEN and DEL were previously described to inhibit Topo II. DEL was also found to decrease the effects of Topo-poisoning chemotherapeutic agents like irinotecan or doxorubicin. Thus, a similar protective effect of the latter polyphenols against AOH-induced genotoxicity seemed conceivable, even more so as polyphenols in general and especially anthocyanidins are also known to counteract oxidative stress. In vitro experiments were conducted with HT-29 colon carcinoma cells to assess such interactions at the levels of cytotoxicity with sulforhodamine B (SRB) and water soluble tetrazolium (WST-1) assays, of genotoxicity with the comet assay, of topoisomerase poisoning with the in vivo complex of 64 enzyme assay and of oxidative stress with the dichlorofluorescein assay. While only weak interactions were observed regarding cytotoxicity, both polyphenols were found to interact antagonistically with the DNA-breaking properties of AOH. Both polyphenols reduced the amount of topoisomerase/DNA complexes stabilized by AOH in the ICE assay, thus interacting with the mycotoxin’s prime mode of action, the topoisomerase poisoning. Furthermore, DEL protected from the induction of oxidative stress by AOH in the DCF assay. Taken together, this study gave a first insight in protective effects of polyphenols against an Alternaria-induced toxic effects. Another mycotoxin produced by Alternaria spp. is altertoxin II (ATX-II), which was recently shown to be the main genotoxic compound of an extract from Alternaria alternata – infested rice. When DEL was co-incubated with this toxin, its protective impact against ATX-II - induced DNA damages by far exceeded the antagonistic effect with AOH in the comet assay experiments. In search of a mechanism, DEL and its degradation products were found to significantly decrease ATX-II levels in aqueous solutions, indicating a direct chemical reaction with the mycotoxin. Conclusively, this thesis demonstrates the high potential of polyphenols, in particular anthocyanins, to interfere with other bioactive compounds. Interactions at a range of different biological levels could be observed, including cytotoxicity, genotoxicity, EGFR activation, topoisomerase poisoning, oxidative stress and chemical degradation. In general the collected data indicates that polyphenols exert mainly antagonistic, i.e. protective, effects. While this seems desirable when it comes to food contaminants it should be taken into account in case of drug interactions, in particular with chemotherapy