Étude de la recombinaison intermoléculaire dans les cellules somatiques de mammifères

La plupart des essais de recombinaison dans les cellules de mammifères sont basés sur la reconstitution d'un marqueur de sélection. Nous avons élaboré un essai intermoléculaire où les recombinants sont isolés sur la base de la présence de séquences provenant des deux molécules parentales. Nous étudions la recombinaison intermoléculaire entre un vecteur procaryotique et un vecteur eucaryotique dans des cellules de souris 3T6. Après cotransfection au DEAE-dextran, l'ADN extrachromosomique est extrait des cellules et les molécules plasmidiques sont isolées par transformation bactérienne. Les plasmides recombinants sont alors identifiés par hybridation in situ avec une sonde provenant de séquences exclusives au vecteur eucaryotique. Les deux vecteurs ont des séquences en commun. Ainsi, notre essai permet de comparer directement les événements de recombinaison intermoléculaire homologue et non-homologue en absence de sélection pour un mécanisme particulier de recombinaison. Nos résultats démontrent que la recombinaison intermoléculaire non-homologue est le mécanisme prépondérant dans les cellules même lorsque les partenaires partagent d'importantes étendues de séquences. De plus, nous démontrons que la fréquence relative des deux types d'événements de recombinaison est influencée par l'étendue de l'homologie entre les deux molécules, par l'état réplicatif du vecteur eucaryotique mais pas par la linéarisation comme telle. En effet, la linéarisation du vecteur procaryotique ou des deux molécules parentales à des sites analogues dans l'homologie n'a pas influencé la fréquence relative des deux mécanismes de recombinaison ni la fréquence de recombinaison totale. Par contre, le rapport des recombinaisons homologues versus non-homologues a augmenté significativement après linéarisation du vecteur eucaryotique ou des deux partenaires à des sites asymétriques dans l'homologie. Les recombinants intermoléculaires homologues isolés ne possèdent pas les deux jonctions générées lors d'un seul événement de recombinaison réciproque. Dans presque tous les cas, ils possèdent plutôt une jonction homologue et une jonction non-homologue. Nous proposons un modèle de recombinaison décrivant les mécanismes menant à leur formation. Selon notre modèle, la jonction homologue est générée par le chevauchement des extrémités homologues permettant l'appariement des séquences entre les deux partenaires. Une ligation bout-à-bout des extrémités libres non-homologues génère la jonction non-homologue