Conservação in vitro e ex situ e valorização de endemismos ibéricos das Apiaceae portuguesas

Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Fisiologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraAs ameaças crescentes à perda de biodiversidade impõem medidas que invertam essa tendência. A fitodiversidade é a base da vida na Terra e indispensável ao funcionamento dos ecossistemas pelo que a sua conservação é urgente, particularmente a de espécies raras e em maior risco, como as endémicas, de habitats e características muito peculiares. O conhecimento de propriedades intrínsecas a estes taxa promove a sua valorização e interesse e o recurso a técnicas de micropropagação in vitro permite a sua preservação pela utilização e aplicação sustentáveis. Neste contexto, propusemo-nos estudar as Apiaceae ibéricas endémicas com representação em Portugal, identificando catorze taxa pertencentes a onze géneros (Angelica, Bunium, Conopodium, Daucus, Distichoselinum, Eryngium, Ferula, Ferulago, Laserpitium, Seseli, Thapsia), 13 endemismos de Portugal e Espanha e um endemismo exclusivamente português, Daucus carota subsp. halophilus. Este taxon e Angelica pachycarpa, Distichoselinum tenuifolium e Seseli montanum subsp. peixotoanum têm uma área geográfica de distribuição mais restrita. Priorizando a colheita sustentada das espécies mais ameaçadas, pelo estudo de Floras, exemplares de Herbário e outra informação disponível, procedeu-se à localização, identificação, conservação e valorização de treze dos taxa, estando apenas Bunium macuca subsp. macuca por localizar. Para isso, foi feito o reconhecimento das localidades e representação em Portugal, em mais de 150 saídas de campo de norte a sul e os respetivos exemplares voucher depositados no Herbário COI. A avaliação do ciclo de vida e fenologia é determinante para a colheita sustentada, tendo-se recolhido 11 taxa para o banco de sementes, dos quais seis foram novidade e integrados pela primeira vez no banco de sementes do Jardim Botânico de Coimbra, Banco de Germoplasma de Braga e do Millenium Seed Bank, em Kew. A reserva no Jardim Botânico foi implementada para a conservação ex situ (sementes e coleções vivas) e in vitro e in situ das plantas, com recurso à micropropagação dos quatro taxa prioritários e respetiva aclimatização em condições naturais. Para a caraterização morfológica dos taxa, e dada a grande complexidade taxonómica da família, recorreu-se a metodologias complementares, como a morfometria, microscopia ótica e de scanning, citometria de fluxo e caracterização de óleos essenciais, para distinguir Daucus carota subsp. maximus das outras três subespécies nativas de Portugal (D. carota subsp. carota; D. carota subsp. halophilus; D. carota subsp. gummifer). Estudos similares permitiram distinguir duas subespécies de Eryngium duriaei, nomeadamente, Eryngium duriaei subsp. duriaei e Eryngium duriaei subsp. juresianum. Nos quatro taxa mais vulneráveis estabeleceram-se protocolos de micropropagação com vista à multiplicação em larga escala. Foram testados diferentes tipos de explantes (ápices caulinares, segmentos foliares, pecíolos e raízes) e diferentes técnicas de micropropagação: proliferação de meristemas, organogénese e embriogénese somática. Para todos os taxa foi possível a regeneração por proliferação de meristemas e por embriogénese somática bem como a respetiva aclimatação de plantas. Para alguns dos taxa foi possível verificar que a cultura in vitro não induziu variabilidade ao nível do cariótipo. Para além dos ensaios de micropropagação, estabeleceu-se também um protocolo de indução floral in vitro em Daucus carota subsp. halophilus tendo-se otimizado as condições de indução de floração e caracterizado este processo de morfogénese quer em termos das condições de cultura quer do desenvolvimento floral por microscopia ótica e eletrónica de varrimento. Os resultados mostraram que o IAA e a BA são importantes na evocação floral. A análise do pólen mostrou que embora este fosse formado in vitro não foi possível conseguir a sua germinação quer em meio sintético quer em polinizações artificiais. Outro aspeto importante do trabalho centrou-se na caracterização dos óleos essenciais de alguns taxa de forma a conseguir a sua valorização e uma mais fácil aceitação em termos de conservação. Este tipo de análises foi realizado em Daucus carota subsp. halophilus, Distichoselinum tenuifolium, Seseli montanum subsp. peixotoanum e Eryngium duriaei, (duas subespécies: Eryngium duriaei subsp. duriaei e Eryngium duriaei subsp. juresianum) e ainda Thapsia minor. A composição química dos óleos foi determinada por cromatografia gás-líquido de alta resolução e cromatografia gás-líquido acoplada a espectrometria de massa. Para a maioria dos óleos foram conseguidas percentagens de identificação superiores a 90%. Os óleos foram obtidos de plantas em diferentes estágios de desenvolvimento, com o objetivo de identificar a fase de maior rendimento em óleo essencial ou que produz óleos de composição particular. Foi feita a avaliação da atividade antifúngica de óleos essenciais com vista à validação científica de usos populares e eventual avaliação do seu potencial industrial. Os óleos essenciais que apresentaram maior atividade antifúngica foram os de Daucus carota subsp. halophilus, ricos em elemicina, particularmente contra dermatófitos e Cryptococcus neoformans. Os óleos essenciais de Distichoselinum tenuifolium e de Thapsia minor também revelaram ter propriedades antifúngicas, sendo o mirceno e o acetato de geranilo, respetivamente, o constituinte químico maioritário do óleo. Os óleos essenciais mostraram ainda poder ser utilizados como importantes auxiliares de diagnóstico quimiotaxonómico na avaliação, certificação e clarificação taxonómica de dois taxa, Daucus e Eryngium, comprovando-se a asarona como marcador para Daucus carota subsp. maximus e α-neocalitropseno, o constituinte químico marcador exclusivo de Eryngium duriaei subsp. juresianum.The increasing threats to biodiversity loss require measures to reverse this trend. The phytodiversity is the basis of life on Earth and vital to the functioning of ecosystems, so their conservation is urgently needed, particularly for rare species and those at higher risks, such as endemics. The knowledge of the intrinsic properties of these taxa promotes their interest and utility and the use of in vitro micropropagation techniques enables its preservation for sustainable use and application. In this context, it was decided to study the Iberian endemic Apiaceae with representation in Portugal, identifying fourteen taxa belonging to eleven genera (Angelica, Bunium, Conopodium, Daucus, Distichoselinum, Eryngium, Ferula, Ferulago, Laserpitium, Seseli, Thapsia), 13 endemic taxa from Portugal and Spain and one endemism restricted to Portugal, Daucus carota subsp. halophilus. This taxon and Angelica pachycarpa, Distichoselinum tenuifolium and Seseli montanum subsp. peixotoanum have a more restricted distribution. Prioritizing sustainable harvesting of the most endangered species, through the study of Floras, herbarium specimens and other available information, we have proceeded to the location, identification, conservation, and enhancement of thirteen of the taxa, being Bunium macuca subsp. macuca the only taxon left to trace. For that, we have made the recognition of locations and representation in Portugal, in more than 150 field trips from north to south and the respective voucher specimens were deposited in the COI Herbarium. The evaluation of the life cycle and phenology is crucial for a sustainable harvesting. Based on this knowledge 11 taxa were collected for the seed bank, from which six were new and integrated for the first time in the seed bank of the Botanical Garden of Coimbra. Samples were also send to the Portuguese Bank of Germoplasm (Braga) and to the Millennium Seed Bank (Kew). An ex-situ collection was also implemented at the Botanic Garden of the University of Coimbra for plants obtained from seeds and from in vitro culture of the four priority taxa. For the morphological characterization of the taxa, and given the great taxonomic complexity of the family, complementary methodologies such as morphology, optical and scanning microscopy, flow cytometry and essential oils characterization were used to distinguish the endemism Daucus carota subsp. maximus from the other three subspecies native of Portugal (D. carota subsp. carota, D. carota subsp. halophilus; D. carota subsp. gummifer). Similar studies were carried out in Eryngium duriaei, to distinguish between Eryngium duriaei subsp. duriaei and Eryngium duriaei subsp. juresianum. For the most vulnerable species protocols of micropropagation were established for large scale propagation. Different types of explants (shoot tip, leaf segments, petioles and roots) were tested as well as different techniques of micropropagation: shoot proliferation, somatic embryogenesis and organogenesis. In the conditions tested propagation was achieved both by shoot proliferation and by somatic embryogenesis and plants have been successfully acclimatized. Flow cytometry analysis showed that at least for some of the taxa analysed no modifications in the karyotype were induced in vitro. In addition to the micropropagation assays, a protocol for floral induction in vitro in Daucus carota subsp. halophilus was established and the conditions for flower induction optimized. Transition from vegetative to reproductive development was analysed by histological and SEM studies. The results showed that the IAA and BA are important in floral evocation. In vitro flowers produced morphologically normal pollen grains but germination in vitro or in the pistil was not achieved. The essential oils of some taxa, namely Daucus carota subsp. halophilus, Distichoselinum tenuifolium, Seseli montanum subsp. peixotoanum and Eryngium duriaei (two subspecies: Eryngium duriaei subsp. duriaei and Eryngium duriaei subsp. juresianum) and still Thapsia minor were characterized and some of their biological activities evaluated trying to make these taxa more interesting for conservation purposes. The chemical composition of the oils was determined by high resolution gas-liquid chromatography and gas-liquid chromatography coupled to mass spectrometry. For most of the oils percentages of identification higher than 90% were obtained. The oils were studied in plants with different stages of development, with the goal of identifying the stage of the greater production of essential oil or oils of particular composition. An evaluation of the antifungal activity of essential oils was made for the scientific validation of popular uses and eventual evaluation of its industrial potential. Essential oils that showed higher antifungal activity were those of Daucus carota subsp. halophilus, with high levels of elemicine and larger capacity against dermatophytes and Cryptococcus neoformans. Distichoselinum tenuifolium and Thapsia minor also revealed antifungal proprieties, being myrcen and geranyl acetate the major chemical compound of the oil, respectively. The analysis of the essential oils also showed to be an interesting tool for chemotaxonomic diagnostic in the assessment, certification and taxonomic clarification of two taxa, Daucus and Eryngium, confirming asarone as a marker for Daucus carota subsp. maximus and α-neocallitropsene, as a chemical component unique of Eryngium duriaei subsp. juresianum.Centro de Ecologia Funcional da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra; Centro de Estudos Farmacêuticos da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra; Fundação Portuguesa EDP/Biodiversidade pelo apoio financeiro no projeto “Conservação e Valorização da Flora Endémica Ameaçada em Portugal”; Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra, com a atribuição da Bolsa de Doutoramento (III/05/2007