Molecular analysis of the cell-cell joining protein Sepj in Anabaena sp. PCC 7120

La multicelularidad se ha desarrollado de forma independiente en el curso de la evolución en diversos grupos filogenéticos, incluidos diferentes grupos bacterianos, e implica universalmente fenómenos de adhesión, comunicación y diferenciación celular. Se encuentran organismos multicelulares en grupos bacterianos como las actinobacterias, las cianobacterias y las mixococcales. Los representantes multicelulares en las cianobacterias son aquellas que crecen formando filamentos de células o tricomas que, en condiciones de escasez de nitrógeno, presentan dos tipos celulares: las células vegetativas que fijan CO2 mediante la fotosíntesis oxigénica y los heterocistos fijadores de nitrógeno atmosférico. La diferenciación de los heterocistos es un proceso que ha sido ampliamente estudiado desde los puntos de vista bioquímico y genético. Otros aspectos de la multicelularidad, como son los mecanismos de adhesión y comunicación intercelular, han sido menos estudiados. En las cianobacterias formadoras de heterocistos, ante la ausencia de nitrógeno combinado en el medio, algunas células vegetativas del filamento se diferencian a heterocistos generando un patrón en el que dos heterocistos están separados por una media de diez células vegetativas. En la cianobacteria modelo Anabaena sp. PCC 7120, el proceso de diferenciación requiere la acción de numerosos reguladores, entre ls que destacan los factores de transcripción NtcA y HetR. NtcA controla la expresión de genes implicados en la asimilación de diferentes fuentes de nitrógeno incluyendo genes implicados en la diferenciación de los heterocistos. HetR parece ser específico de la diferenciación, y su actividad se inhibe por morfógenos derivados de PatS y HetR, que impiden la diferenciación de un número excesivo de heterocistos. Durante el crecimiento diazotrófico, los heterocistos y las células vegetativas intercambian nutrientes: compuestos reducidos de carbono son transferidos al heterocisto y nitrógeno fijado a las células vegetativas. Morfológicamente, las cianobacterias se caracterizan por tener una envuelta celular de tipo Gram negativo, con una membrana externa por fuera de la capa de peptidoglicano que rodea a la membrana citoplasmática. En las cianobacterias filamentosas, la membrana externa es continua a lo largo del filamento, lo que determina la presencia de un periplasma que es funcionalmente continuo. Esto abre la posibilidad de que el espacio periplásmico sea una vía de comunicación entre las células del filamento. Además, la capa de peptidoglicano y la membrana externa continua también contribuyen a la integridad del filamento. Sin embargo, en el filamento cianobacteriano las células se encuentran conectadas por unas estructuras proteicas conocidas como septal junctions, que atraviesan las capas de peptidoglicano que se localizan entre las células a través de unas perforaciones en las mismas denominadas nanoporos. Estas estructuras podrían estar implicadas en la transferencia intercelular de compuestos además de jugar un papel en el mantenimiento de la integridad del filamento. La transferencia intercelular ha sido estudiada en cianobacterias formadoras de heterocistos usando sondas fluorescentes que incluyen la calceína, la 5--‐carboxifluoresceína y la esculina, un análogo fluorescente de la sacarosa. Entre los componentes propuestos de las septal junctions están las proteínas septales FraC, FraD y SepJ. La localización de SepJ se ha estudiado mediante fusión con GFP y se localiza en el polo de forma focalizada, aunque se puede observar formando un anillo en células que se están dividiendo. Un mutante sepJ presenta un fenotipo de fragmentación y es incapaz de crecer diazotróficamente, ya que en él la diferenciación de heterocistos se aborta en una fase temprana. Además, el mutante sepJ está afectado en la transferencia intercelular de calceína y presenta un número reducido de nanoporos, mientras que la sobreexpresión de SepJ resulta en un incremento en el número de nanoporos. SepJ contiene cuatro dominios: (i) una secuencia conservada de 26 aminoácidos en parte N--‐terminal; (ii) un dominio coiled--‐coil que podría estar implicado en interacciones proteina--‐proteína; (iii) un domino linker rico en prolina y serina; y (iv) un domino integral de membrana (domino permeasa) que muestra homología con proteínas de la superfamilia DMT (Drug/Metabolite Transporter). El divisoma es un complejo multiproteico que se encarga de llevar a cabo la división celular en bacterias. Los genes implicados en la división celular en cianobacterias han sido identificados mediante análisis comparativos y solo algunos de ellos han sido objeto de estudio directo. Las cianobacterias presentan genes de división celular previamente identificados en bacterias Gram negativas, algunos presentes en bacterias Gram positivas y, además, otros exclusivos que no presentan homólogos en otras bacterias. En Anabaena, algunos de los genes identificados son ftsZ, que determina la proteína FtsZ encargada de formar el anillo Z, ftsQ y ftsW. Basado en la observación de la proteína SepJ--‐GFP formando un anillo en el sitio de división celular, el primer objetivo de esta tesis fue estudiar la relación que podría tener SepJ con la maquinaria de división. Para ello se construyó un mutante condicional del gen esencial ftsZ. En la estirpe mutante, llamada CSFR18, el gen ftsZ se encuentra bajo un promotor regulado por NtcA y, consistentemente, los niveles de proteína FtsZ dependían de la fuente de nitrógeno presente en el medio. Cuando el amonio estaba presente en el medio, los niveles de FtsZ eran bajos, lo que dificultaba la división celular provocando que la estirpe mostrara una morfología aberrante y observándose, finalmente, la lisis de los cultivos. Cuando la fuente de nitrógeno era nitrato, los niveles de FtsZ eran algo más bajos que en la estirpe silvestre en las mismas condiciones, pero suficientes para permitir la división celular aunque el área celular se veía algo afectada. En condiciones diazotróficas, los niveles de FtsZ en la estirpe CSFR18 eran similares a los de la estirpe silvestre, permitiendo una morfología normal. La localización de SepJ fue analizada mediante inmunofluorescencia y se pudo ver cómo SepJ no se localizaba en el septo en la estirpe CSFR18 cuando ésta se incubaba en presencia de amonio como fuente de nitrógeno. Un análisis complementario, usando berberina, un inhibidor de la polimerización de FtsZ, corroboró que la localización de SepJ en el septo requería la maquinaria de división. También se generó un mutante condicional, llamado CSFR5, del gen ftsQ que se localiza justo aguas arriba de ftsZ. El promotor utilizado fue también el promotor sintético activado por NtcA. Desafortunadamente, la estirpe CSFR5 no mostró una alteración fenotípica evidente. Se encontró que ftsQ es un gen de baja expresión, haciendo que en la estirpe CSFR5 los niveles de expresión de ftsQ obtenidos con el promotor sintético regulado por NtcA fuesen siempre mayores que aquellos observados en la estirpe silvestre. De esto se puede concluir que la sobreexpresión de ftsQ no tiene efectos evidentes en la capacidad de división de las células de Anabaena. Otra parte de la tesis doctoral se ha centrado en el estudio de la capacidad de SepJ para interaccionar consigo misma y con otras proteínas o estructuras celulares. La presencia de un extenso dominio coiled--‐coil en la proteína SepJ hacía pensar que ésta podría tener la capacidad de interaccionar con otras proteínas. Primero se analizó la capacidad de polimerización del dominio coiled--‐coil aislado mediante cromatografía de exclusión molecular, viendo que era capaz de formar multímeros. La presencia de complejos de SepJ en las membranas de Anabaena se analizó después usando una estirpe que expresaba la proteína de fusión SepJ--‐GFP--‐His10. Mediante un procedimiento de doble purificación, se comprobó que SepJ podría estar formando hexámeros en la membrana de Anabaena, pero no se obtuvo ninguna indicación de que en estos complejos pudiera participar otra proteína de forma estable. La capacidad de SepJ de interaccionar consigo misma también se estudió mediante el sistema del doble híbrido bacteriano. Nuestros resultados mostraron que SepJ puede interaccionar consigo misma y que tanto el dominio coiled--‐coil como el linker están involucrados en esta interacción. También se analizó mediante doble híbrido la interacción de SepJ con algunas proteínas implicadas en la división celular. SepJ resultó interaccionar fuertemente con la proteína FtsQ, encargada de reclutar componentes tardíos del divisoma. Esta interacción se corroboró mediante ensayos de co--‐purificación, en los que las dos proteínas fueron expresadas en E. coli. Otras proteínas que podrían interaccionar con SepJ son las proteínas FraC y FraD, que se localizan también en el septo, pero los ensayos de doble híbrido no mostraron interacción entre SepJ y estas proteínas. SepJ sí interaccionó en ensayos de doble híbrido con SjcF1, una proteína de unión a peptidoglicano que parece estar implicada en la regulación del tamaño de los nanoporos, la cual también interacciona con FraC. Además, fue analizada la interacción entre SepJ y peptidoglicano aislado de Anabaena. La proteína SepJ purificada mostró capacidad de unión a peptidoglicano, al igual que el dominio coiled--‐coil aislado. La capacidad de SepJ para formar hexámeros y su interacción con SjcF1 y con el peptidoglicano apoyan la idea de que SepJ forme parte de un tipo de septal junctions que intervendrían en el anclaje celula--‐célula y la transferencia intercelular de compuestos. En la última parte de este trabajo se analizó el papel de SepJ en la transferencia intercelular de compuestos en Anabaena. Para ello, se construyeron una serie de mutantes de SepJ con alteraciones en el dominio permeasa. Primero se construyó una estirpe, llamada CSVM90, que expresaba una versión de SepJ que contaba solo con el primer segmento transmembrana. Esta estirpe mostró un fenotipo muy similar a un mutante de deleción de sepJ, aunque sus niveles de transferencia de calceína eran algo mayores. La estirpe CSVM90 también tenía un mayor número de nanoporos que una estirpe de deleción, aunque menos que una estirpe control en la que se reconstruyó el gen sepJ. A partir de la estirpe CSVM90 se construyó una serie de mutantes que contenían mutaciones puntuales de residuos conservados del dominio permeasa, deleciones de los dos y cuatro últimos segmentos transmembrana del mismo y pequeñas deleciones (una incluyendo un loop citoplásmico y otra la cola C--‐terminal de la proteína). Algunos mutantes mantenían el fenotipo de fragmentación de la estirpe parental CSVM90, pero otros recuperaron la capacidad de crecer formando filamentos largos. Entre estos últimos mutantes se distinguían dos grupos: los de un grupo estaban afectados en la transferencia de calceína y presentaban algunos heterocistos contiguos después de 48 h de incubación sin nitrógeno combinado (fenotipo MCH, de multiple contiguous heterocysts); los del otro grupo no estaban afectados en la transferencia de calceína pero presentaban fenotipo MCH tanto a las 24 h como a las 48 h de incubación sin nitrógeno combinado. El fenotipo MCH denota una alteración en la transferencia intercelular de los morfógenos PatS y HetN. Estos mutantes permiten por lo tanto discriminar entre las funciones de anclaje y comunicación de SepJ y apoyan la idea de que SepJ sea un componente de las septal junctions contribuyendo tanto al papel de anclaje como al papel funcional (comunicación celula--‐ célula) de estas estructuras