Assessing the diversity of agrobacterial populations

Agrobacterium are Alphaproteobacteria common in most soils that closely interact with plants in two respects. Firstly, they are rhizospheric bacteria saprophytically living in the rhizosphere of numerous plants and they are likely beneficial to plants. Secondly, when they harbor a dispensable Ti plasmid (i.e. tumor inducing plasmid), agrobacteria are plant pathogens able to cause the crown gall disease to most dicots and gymnosperms and some monocots. An epidemiological survey of crown gall thus also requires expert determination of the Agrobacterium taxonomy. In this thesis we evaluated the usefulness of MALDI-TOF MS technique as a high throughput tool to determine and classify agrobacteria. Then we set up a recA-based PCR method to accurately and exhaustively assess agrobacterial diversity either of isolated agrobacteria or directly in various biotopes. We applied standard biochemical, recA-based and Ti plasmid-based identification methods to study the prevalence of pathogenic and non-pathogenic agrobacteria at the country and local scales. Finally, we tested whether analyzing the internal composition of recA amplicons could be a way to directly assess the micro-diversity of agrobacterial populations using cloning sequencing or pyrosequencing approaches. The later methodology was applied to establish the actual field diversity of Agrobacterium and to evaluate whether plant genotypes differentially select agrobacteria in their root systems, providing first data upon biotic factors shaping the population structure of agrobacteriaLes bactéries du genre Agrobacterium forment un ensemble taxonomiquement diversifié composé de nombreuses espèces, présent dans la plupart des sols et des rhizosphère. Les agrobactéries sont le plus souvent anodines voire stimulatrices de la croissance des plantes. Par contre, celles qui hébergent un plasmide Ti induisent la maladie de la galle du collet à de nombreuses plantes d'intérêt agronomique. Dans ce contexte, nous avons d'une part donné l'état actuel des connaissances sur la taxonomie du genre Agrobacterium, et nous avons fait une revue des méthodes d'isolement et de typage de ces bactéries. D'autre part, nous avons cherché à mettre au point des méthodes d'identification rapides et fiables des différentes espèces d'agrobactérie. La méthode de MALDI-TOF MS a permis d'identifier les espèces mais elle n'était pas assez résolutive pour typer des souches et encore moins la présence de plasmides Ti dans les isolats. Nous avons alors développé des amorces de PCR spécifiques de 17 espèces, du genre Agrobacterium et de la famille Rhizobiaceae. Ces amorces se sont révélées efficaces pour identifier les bactéries cultivées et aussi pour détecter leur présence dans des communautés microbiennes. Nous avons utilisé ces outils pour étudier la répartition des agrobactéries à l'échelle d'un pays, d'une station et entre sols nus et sols rhizosphériques en utilisant soit des isolats soit des ADN extraits des différents environnements. Enfin, nous avons montré que le clonage-séquençage ou le séquençage à haut débit d'amplicons obtenus à partir d'ADN de communautés microbiennes nous permettaient de connaître la diversité des populations d'agrobactérie