Étude de l'interaction de peptides antimicrobiens avec des bactéries intactes par résonance magnétique nucléaire

Le développement de nouveaux antibiotiques, motivé par la résistance bactérienne, possède un grand intérêt pour les peptides antimicrobiens (AMPs) ayant un mécanisme d'action basé sur la perturbation membranaire. L'objectif de ce projet était d'approfondir nos connaissances sur le mécanisme d'action de la caérine 1.1 et de l'auréine 1.2, deux AMPs extraits de la peau de grenouilles australiennes et très actifs contre les bactéries. Pour ce faire, la résonance magnétique nucléaire de l'état solide (RMN-ÉS) in vivo a été employée car elle tient compte de tous les constituants de la paroi cellulaire. Dans un premier temps, nous avons réalisé le marquage des membranes d'E. coli (Gram-) et de B. subtilis (Gram+) avec l'utilisation de l'acide palmitique deutéré PA-d31 afin de les étudier par RMN-2H. Nos résultats montrent que le profil lipidique d'E. coli marquée est similaire à celui d'E. coli sauvage avec l'ajout de l'OA au PA-d31, mais cet ajout n'est pas nécessaire dans le cas de B. subtilis. Le taux de marquage de ~70% pour les deux bactéries procure un bon rapport signal sur bruit lors des analyses de RMN-2H. Nous avons par la suite exploré l'application de la rotation à l'angle magique (MAS, magic angle spinning) en RMN-ÉS. En plus de permettre un gain en temps pendant l'analyse et un gain en sensibilité, les informations dynamiques extraites par le calcul des moments spectraux sont similaires à celles obtenues en mode statique. Les expériences de RMN-ÉS-2H en MAS réalisées sur les deux bactéries, en absence et en présence des AMPs, montrent que la caérine 1.1 et l'auréine 1.2 provoquent le désordre des membranes bactériennes. Contrairement à l'observation de cet effet à la concentration minimale inhibitrice (CMI) des peptides chez E. coli, une concentration supérieure à la CMI est nécessaire pour B. subtilis. Ce résultat semble indiquer que les acides téichoïques du peptidoglycane (PGN) interagissent avec les AMPs et entravent leur accès aux membranes lipidiques. Dans le but à long terme de vérifier cette hypothèse, nous avons étudié les bactéries intactes par RMN-13C afin de les caractériser dans un premier temps et identifier les signaux des constituants du PGN. Cependant, la complexité des spectres entiers empêchent une attribution complète. Nous avons donc tenté d'effacer les signaux des lipides afin de simplifier les spectres. Pour ce faire, des lipides totaux et des lipides polaires, hydrolysés et non, ainsi que les acides palmitique et oléique, tous non marqués, ont été ajoutés dans le milieu de culture des bactéries en présence du glycérol-13C3. Cette méthode a contribué à la diminution de l'intensité de tous les pics des lipides avec un meilleur taux d'effaçage dans le cas des acides gras par rapport aux lipides totaux. L'étape d'hydrolyse des lipides est donc nécessaire. De plus, cette méthode d'effaçage nous a permis d'observer un meilleur taux d'effaçage dans le cas de B. subtilis, et ceci peut être dû à la différence des parois cellulaires d'E. coli (Gram-) et B. subtilis (Gram+).\ud ______________________________________________________________________________ \ud MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : peptides antimicrobiens, bactérie à Gram négatif, bactérie à Gram positif, rotation à l'angle magique, interaction membranaire, structure