Relatório de Estágio

Tese de mestrado, Análises Clínicas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015A diabetes tipo 1 (DT1) é uma doença de causa autoimune. A infiltração linfocitária do pâncreas contendo células T citotóxicas, T auxiliares (T helper, CD4+), macrófagos e células B, que leva à inflamação local e destruição das células β produtoras de insulina, constitui o evento patológico particular de diabetes autoimune, denominado insulíte. No entanto, mecanismo fisiopatológico exacto da doença e os os eventos que levam à insulíte não estão totalmente esclarecidos. Nos ilhéus infiltrados de doentes com diabetes tipo 1 e do ratinho diabético não obeso (Non obese diabetic - NOD), um modelo animal de diabetes auto-imune espontânea, encontram-se populações de células T CD8+ e T CD4+. Além da contribuição da imunidade celular, as células B desempenham um papel importante na doença. Vários estudos confirmaram a importância das células B. A imunidade humoral pode contribuir para patogénese através da acção dos auto-anticorpos (AAcs). Células B podem ainda contribuir para a doença pela apresentação aberrante de auto-antigénios (AAgs) às células T. Recentemente foi demonstrado que as células B podem secretar diversas citocinas. A diabetes autoimune é uma doença multifactorial de etiologia complexa. Identificou-se uma panóplia de genes de susceptibilidade à DT1. Em particular, genes da região Major Histocompatibility Complex (MHC), ou no caso particular dos humanos, a região Humal Leucocyte Antigen (HLA), conferem cerca de 50% do risco total. O modelo actual da patogénese da DT1 demonstra que num indivíduo, a coincidência de predisposição genética, factores ambientais próprios e desregulação dos mecanismos de tolerância imunológicos, levam ao início da insulíte. Ao longo do desenvolvimento da inflamação causada pela insulíte, células β morrem sobretudo por apoptose. Com a progressão da insulíte, cerca de 80% das células β são destruídas. Neste estadio surge o quadro clínico de DT1. O diagnóstico da DT1 baseia-se na sintomatologia convencional de diabetes mellitus, como polidipsia, poliúria, polifagia e hiperglicemia. Até à data não existe nenhum método que permita avaliar directamente os estadios da destruição das células β dentro dos ilhéus de Langerhans. No entanto, existem marcadores que mostram duma forma indirecta a presença do ataque autoimune no tecido. Estes marcadores são anticorpos IgG contra a enzima descarboxilase do ácido glutâmico (Glutamic acid decaboxilase - GAD), insulina, e outros antigénios (Ags) importantes relaccionados com DT1. Existe uma necessidade de definir marcadores da doença, que aparecem antes do aparecimento da insulíte, ou nos estadios iniciais da inflamação. Estudos prévios demonstraram evidências para o papel das células B1a de ratinho NOD e do repertório de IgM autoreactivo, que estas células secretam, em estádios iniciais do processo auto-imune. O potencial autoreactivo das IgM no NOD, que surge sem imunização prévia, sugere que este repertório específico pode estar controlado ao nível genético. Neste trabalho experimental colocámos a hipótese de que IgMs derivados de células B1a de NOD com reactividade para insulina poderiam induzir stress nas células β. Para testar esta hipótese foram estabelecidos ensaios in vitro, para medir stress oxidativo, produção de óxido nítrico e viabilidade em linhas celulares de células β. Os resultados demonstraram que há aumento de stress e diminuição de viabilidade nas linhas celulares em resposta a estímulos pro-inflamatórios de citocinas. Contudo a presença de IgM derivado de hibridomas establecidos a partir de células B1a do NOD não levou a alterações na produção de espécies de oxigénio reactivo (Reactive oxigen species - ROS), óxido nítrico (ON) ou viabilidade. Em estudos anteriores foi demonstrado que polimorfismos genéticos no locus da cadeia pesada da Imunoglobulina (IgH) humana, nomeadamente na região que codifica o IgM estão associados a susceptibilidade para a DT1 e níveis de IgM anti-GAD mais elevados. Na segunda parte deste trabalho foi testado se os níveis totais de IgM nos doentes com DT1 e familiares em primeiro grau estão sob o mesmo controlo genético que os níveis de IgM anti-GAD. Para tal, foram determinados os níveis de IgM total nestes dois grupos e efectuados testes de associação genética do locus IgH humano aos níveis de IgM totais do soro nos doentes com DT1, numa pequena população de 409 participantes (incluindo familiares saudáveis).Observámos que apesar dos níveis de IgM serem significativamente mais elevados no grupo dos doentes comparativamente ao grupo dos familiares, não estão sob controlo do locus IgH. Curiosamente, embora se observe correlação entre maior nível de IgM total e maior nível de IgM anti-GAD no grupo dos familiares esta correlação perde-se no grupo dos doentes. Assim, o aumento de IgM anti-GAD observado no grupo de doentes com DT1 é independente dos níveis totais de IgM .Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease. The pancreatic infiltration containing cytotoxic T cells, T helper cells, macrophages and B cells, leads to local inflammation and β cell destruction and constitutes a particular pathologic event in T1D, named insulitis. However, the exact pathological mechanisms that drive the disease and the events that lead to insulitis development are not fully understood. Within the infiltrated islets of T1D patients and the non-obese diabetic (NOD) mouse, an animal model for spontaneous autoimmune diabetes, both lymphocytic populations are found, namely T CD8+ and T CD4+. Besides the contribution of cellular immunity, B cells play an important role in disease. Numerous studies confirmed the importance of B cells. The humoral immunity could contribute to the disease through auto-antibodies. On the other hand, B cells could also present aberrant auto-antigens to T cells. Recently, it was demonstrated, that B cells can secrete different types of cytokines. Autoimmune diabetes is a multifactorial disease of a complex etiology. A great number of genes associated with T1D susceptibility were identified. Particularly, Major Histocompatibility Complex (MHC) genes, or Human Leucocyte Antigen (HLA) genes in humans, confer around 50% of total risk for disease development. The current model for T1D pathogenesis shows that, a coincidence of genetic susceptibility, environmental factors and break in the mechanisms of immunological tolerance, leads to the beginning of insulitis. With the progression of insulitis, β cells die, mainly by apoptosis. In the stage of insulitis, when almost 80% of β cells are destroyed, overt diabetes appears. The diagnosis for T1D is based on clinical signs and symptoms, including polydipsia, polyuria, polyphagia and hypeglycemia. Until now, no available methods exist for direct recognition of β cell destruction in the pancreatic islets of Langerhans. However, there are markers that indirectly correlate with the autoimmune process. These markers are IgG antibodies present in the serum, namely IgG anti-GAD, anti-insulin, and also IgGs against other antigens related to T1D. There is a growing requirement for disease markers,that appear before insulitis development, or in early inflammation stages. Previous studies showed evidences for the role of B1a lymphocytes of NOD mice together with the autoreactive IgM repertoire they produce, in the beginning of the autoimmune process. The auto-reactive potential of IgM from NOD mice, which appears before any previous immunization, suggests that this specific repertoire could be under genetic control. In this experimental work we put forward the hypothesis that insulin-reactive IgM derived from NOD B1a could induce cell stress in β cells. To test our hypothesis, we established in vitro assays to determine oxidative stress, nitric oxide production and cell viability in β cell lines. The results demonstrated a rise in cell stress and a decrease in cell viability in cell lines in presence of pro-inflammatory cytokines. However, IgM obtained from hybridomas that were established from NOD B1a lymphocytes, didn’t affect reactive oxygen species (ROS) production, nitric oxide levels or cell viability. Previously, it was demonstrated the association of genetic variability in the human heavy chain (IgH) locus, namely in the IgM coding region, to T1D susceptibility and higher levels of IgM anti-GAD. In the second part of this work, we tested whether the levels of total IgM in T1D patients and their relatives are under the same genetic control as IgM anti-GAD. To achieve this aim, the total IgM levels were measured in T1D patients and their relatives. Genetic association tests of total IgM levels to variability in IgH locus were effectuated, in both experimental groups, with a total of 409 participants. We observed that total IgM levels in patients were significantly higher comparing with relatives. Nevertheless, the total IgM levels were not under the IgH locus control. Curiously, the significant correlation between total IgM and anti-GAD IgM levels in the relatives was not observed in the patients group. Thus, the rise in anti-GAD IgM in diabetic patients is independent of the total IgM level