Characterization of the Biological Activity of Pru p 3 in Plant and Intestinal Epithelium

La alergia es un problema social que supone una grave disminución de la calidad de vida del paciente, estando considerada como la mayor enfermedad crónica en Europa en la actualidad. Desde mediados del siglo XX, se ha producido un incremento en la prevalencia de esta enfermedad aunque el origen de este incremento es todavía desconocido. Para prevenir y tratar este tipo de enfermedades es necesario conocer el mecanismo por el cual una proteína se convierte en alergénica. El objetivo principal de esta Tesis ha sido estudiar los mecanismos moleculares que están implicados en los procesos de sensibilización alérgica. Evidencias crecientes sugieren que los lípidos transportados por determinados alérgenos pueden ser reconocidos por receptores celulares del sistema inmune, pudiendo tener un papel destacado en la sensibilización alérgica. En este trabajo se ha escogido como modelo Pru p 3, alérgeno principal del melocotón y proteína transportadora de lípidos, (lipid transfer protein, LTP). El ligando lipídico de Pru p 3 se ha caracterizado estructuralmente por primera vez empleando ESI-micrOTOF-QII. Así, el ligando se ha identificado como un derivado hidroxilado de camptotecina unida a fitoesfingosina, segmento que forma una cola hidrocarbonada que se inserta en el túnel hidrofóbico de la proteína. La naturaleza química del ligando ha sido confirmada mediante ensayos de inhibición de la topoisomerasa I y emisión de fluorescencia a 254 nm, ambas características típicas de la camptotecina. Por otra parte, combinando diferentes técnicas in vitro (como RT-PCR e inmunohistoquímica), se ha caracterizado el posible papel del ligando en planta. La máxima expresión de Pru p 3 se detectó en los estilos de flores polinizadas, en contraste con su ausencia en no polinizados donde su expresión disminuye tras la antítesis. Además, la mayor expresión de Pru p 3 se localizó en piel, más concretamente en los tricomas, pero no en la pulpa. Estos datos, junto con la inhibición de la germinación del polen por parte del ligando, sugieren que Pru p 3 puede inhibir una segunda polinización y mantener alejados los herbívoros hasta la maduración de la semilla. Igualmente, se ha evaluado la actividad inmunológica del ligando lipídico empleando diferentes modelos in vitro (como moDC, PBMCs, THP1 y células epiteliales como Caco2) y un modelo de ratón de anafilaxia. Así se ha determinado que el ligando es capaz de modular el sistema inmune a través de una respuesta Th2, siendo el responsable de la activación de las células presentadoras de antígeno y aumenta la capacidad de sensibilización alérgica a Pru p 3 en el modelo de ratón. Además, el ligando es presentado por el receptor CD1d en las células epiteliales, activando a continuación las células iNKT. Estos resultados se han confirmado con un empleo del modelo ex vivo InTESTineTM con fragmentos de tejido de cerdo. De este modo se ha podido observar que el ligando no afecta al transporte de Pru p 3 a través de la barrera intestinal aunque parece que Pru p 3 queda acumulado en las Placas de Peyer. Por otra parte, se ha observado que la presencia del ligando induce la expresión de citoquinas típicas de una respuesta Th2 como IL4 e IL13. Igualmente se ha confirmado que Pru p 3 co-localiza con el receptor CD1d en presencia del ligando y que aumenta la presencia de células iNKT. En resumen, este trabajo representa un nuevo enfoque sobre los mecanismos que caracterizan la alergia, aportando resultados de gran utilidad tanto para la mejora del diagnóstico como para nuevas investigaciones sobre esta enfermedad. ----------ABSTRACT---------- Allergy is a serious social problem that impairs the quality of life of patients and is currently considered the most prevalent chronic disease in Europe. A large increase in its prevalence has occurred since the mid-twentieth century. However, the underlying causes for this increase and the factors that trigger allergy are still unknown. Knowing why a protein becomes an allergen would be essential in the prevention and treatment of allergy diseases. The main aim of this doctoral thesis was to study the molecular mechanisms involved in the allergic sensitization processes. Increasing evidence suggests that lipids transported by certain allergens can be recognized by cellular receptors of the immune system, and may play a prominent role in allergic sensitization. In this work, Pru p 3, the major allergen of the peach and a lipid-transfer protein (LTP), has been chosen as model. The lipid ligand of Pru p 3 has been structurally characterized for the first time using ESI-micrOTOF-QII. The ligand has thus been identified as a hydroxyl derivative of camptothecin bound to phytosphingosine, a hydrocarbon tail which is inserted into the hydrophobic tunnel of the protein. This result was validated by assays of inhibition of topoisomerase I as well as fluorescence emission at 254 nm, both features characteristic of camptothecin. Additionally, different in vitro techniques (such as RT-PCR and immunohistochemistry) were combined to characterize the possible role of the ligand in plant. The highest expression of Pru p 3 was detected in pollinated styles by contrast to its absence in non-pollinated flowers where the expression decreased after the antithesis. Besides, the highest expression of Pru p 3 was localized in the tricomas, but not in the pulp. These data, together with the inhibition of pollen germination by the ligand, suggest that Pru p 3 can inhibit a secondary pollination and keep herbivores away until seed maturation. Additionally, the immunological activity of the lipid ligand was evaluated using different in vitro models (moDC, PBMCs, THP1, and Caco2) and a mouse model of anaphylaxis. Thus, it was determined that the ligand was capable of modulating the immune system through a Th2 response, responsible for the activation of antigen presenting cells, and in increasing the capacity of allergic sensitization to Pru p 3 in a mouse model. Furthermore, the ligand was introduced by the CD1d receptor into the epithelial cells to activate iNKT cells. These results have been validated using the ex vivo model InTESTineTM with fragments of pig tissue. The ligand did not affect the transport of Pru p 3 through the intestinal barrier, but appears to remain accumulated in Peyer's Patches. The presence of the ligand was also observed to induce the expression of cytokines that are typical of a Th2 response like IL4 and IL13. Moreover, it was confirmed that Pru p 3 co-localized with the CD1d receptor in the presence of the ligand, as well as increasing the presence of iNKT cells. In summary, this thesis work represents a novel approach to characterize allergic response mechanisms and presents results which are useful for improving diagnosis and for providing a basis for new investigations related to allergy