Proteômica abrangente de alta resolução na análise de neutrófilos humanos ativados pelo peptideo formyl Methyl Leucyl Phenylalanine (fMLP)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017.Os neutrófilos são granulócitos polimorfonucleares que utilizam mecanismos intra e extracelulares para eliminar patógenos. A ativação de neutrófilos pela N-formil-Metionil-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), uma molécula quimiotáctica liberada de bactérias Gram-positivas, disparadores de explosão respiratória, modificações morfológicas, degranulação e liberação de NETs. No entanto, a desregulamentação de neutrófilos está envolvida com várias patologias, em parte, devido à exacerbação da descarga de espécies reativas de oxigênio e enzimas citolíticas Embora haja um número considerável de estudos sobre condições, as questões sobre como essas desregulações permanecem sem resposta; Para os caminhos exatos que são percorridos por esses caminhos intracelulares ainda estão preenchidos com lacunas. Atualmente, a comunidade científica vem usando uma ferramenta de análise conhecida como espectrometria de massa (MS) para desempenhar melhor o papel dos neutrófilos na resposta imune; a realização de estudos relacionados aos neutrófilos de proteômica comparativa são ferramentas essenciais para a compreensão dos mecanismos intracelulares que regem a resposta inflamatória. Usando ferramentas proteômicas de alta resolução, o presente trabalho identificou 8362 proteínas no total, na ativação de neutrófilos por fmp de 100 nmL / L. Em conclusão este trabalho representa a eficiência dos métodos de análise proteômica proporcionaram a identificação de 8362 proteínas, sendo 301 proteínas reguladas diante do estímulo com fMLP. Pois, proteínas importantes para a resposta inflamatória dos neutrófilos foram identificadas, mostrando que a análise comparativa dos mapas proteômicos utilizando diferentes métodos de aquisição e extração proteicas atuaram de forma complementar na robustez da identificação mais abrangente de proteínas de neutrófilos, tanto quiescentes quanto ativados com fMLP. Ademais, E que existe uma forte conexão entre a família das pequenas GTPases com a maioria dos processo desencadeados pela ativação de vias por fMLP, como por exemplo as evidências de alterações estruturais em MEV. Com as análises conjugadas será possível sugerir pontos de modulação da resposta inflamatória promovidas por agentes ativadores relacionados a receptores ligados a proteína G. A identificação de regulações por subunidades do proteassoma 26S tendo extensa participação nas vias reguladas, o que pode ser um indicativo para um mecanismo de regulação por esse complexo. Outrossim, a proteômica se mostra uma ferramenta essencial para a análise de vias, pois proporciona a identificação de proteínas que estão em pequenas quantidades como citocinas liberadas pela ativação. No mais, os mecanismos de morte celular programada com divergência entre vias de ativação e bloqueio da apoptose, podendo acarretar desregulação pois os dados tentem a sugerir um fino balanço entre as vias de vida e morte. O presente trabalho apresenta um conjunto de proteínas com diversas funções relacionadas aos processos da resposta inflamatória, que incluem a atividade oxidativa, motilidade, metabolismo energético e sinalização intra e intercelular. Este estudo adiciona dados relacionados à ativação de neutrófilos por fMLP, também revelando proteínas que não foram previamente identificadas em neutrófilos, ampliando as possibilidades de modulação da resposta inflamatória. Nosso estudo também comtempla o maior número de proteínas nos neutrófilos ativados por fMLP, ampliando assim as possibilidades de sugerir uma modulação da resposta inflamatória em neutrófilos.Neutrophils are polymorphonuclear granulocytes that use intra- and extracellular mechanisms to eliminate pathogens. Activation of neutrophils by N-formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP), a chemotactic molecule released from gram-positive bacteria, triggers respiratory burst, morphological modifications, degranulation and NETs´ release. However, neutrophils´ deregulation are involved with several pathologies, in part, due to the exacerbated discharge of reactive oxygen species and cytolytic enzymes; in other words, prolonged lifespan of activated neutrophils and their migration to non-injured tissues may result in severe clinical conditions. Although there are a considerable number of studies on conditions, questions about how such deregulations still remain unanswered; For the exact pathways that are traversed by these intracellular pathways are still filled with gaps. Currently, the scientific community has been using an analysis tool known as mass spectrometry (MS) to better play the role of neutrophils in the immune response; studies related to comparative proteomics neutrophils are essential tools for understanding the intracellular mechanisms governing the inflammatory response. In conclusion, this work represents the efficiency of the methods of proteomic analysis, which allowed the identification of 8362 proteins, 301 of which were regulated proteins before the stimulation with fMLP. Because proteins important for the inflammatory response of neutrophils were identified, showing that the comparative analysis of proteomic maps using different methods of protein acquisition and extraction acted in a complementary way in the robustness of the more comprehensive identification of neutrophil proteins, both quiescent and activated with fMLP . In addition, there is a strong connection between the family of small GTPases with most of the processes triggered by the activation of fMLP pathways, such as the evidence of structural alterations in SEM. With the conjugated analyzes it will be possible to suggest modulation points of the inflammatory response promoted by activating agents related to G protein-linked receptors. The identification of 26S proteasome subunit regimens having extensive participation in the regulated pathways, which may be indicative of a mechanism of regulation by this complex. In addition, the mechanisms of programmed cell death with divergence between activation pathways and apoptosis blockade, may lead to deregulation as the data try to suggest a fine balance between the life and death pathways. The present work presents a set of proteins with diverse functions related to the processes of the inflammatory response, which include oxidative activity, motility, energetic metabolism and intra and intercellular signaling. This study adds data related to the activation of neutrophils by fMLP, also revealing proteins that were not previously identified in neutrophils, increasing the possibilities of modulation of the inflammatory response. Our study also contemplates the largest number of proteins in the neutrophils activated by fMLP, thus increasing the possibilities of suggesting a modulation of the inflammatory response in neutrophils