Anwendung und de novo Design von künstlichen Genschaltern für Aspergillus niger

Aspergillus niger ist ein filamentöser Pilz, der industriell für die Produktion von organischen Säuren und Proteinen genutzt wird. In den letzten Jahren konnte darüber hinaus die Produktion von homo- und heterologen Sekundärmetaboliten gezeigt werden. Obwohl sich A. niger genetisch verändern lässt, gibt es nur wenig induzierbare Genexpressionssysteme. Außerdem ist die Ko-Expression von mehreren Genen schwierig. Deshalb war es Ziel dieser Dissertation: i) ein neues Genexpressionssystem zu entwickeln, ii) Gene polycistronisch zu exprimieren sowie iii) zwei Sekundärmetabolitcluster mithilfe verschiedener genetischer Strategien zu aktivieren. Ein bakterielles Genregulationssystem wurde für A. niger adaptiert. Dieses nutzt intrazellulär gebildetes Citrat als induzierendes Molekül und kann somit als autogen reguliertes System verstanden werden. Das Regulationsprotein CcpC wurde mit der zugehörigen Operatorsequenz und dem Reportergen Luziferase heterolog in A. niger exprimiert. Verschiedene Genexpressionskassetten wurden hierfür erstellt und durch Messung der Lumineszenz charakterisiert. Keines der analysierten Systeme zeigte die erwartete Reportergenaktivität, so dass weitere Op- timierungsschritte notwendig sind. Die Ko-Expression mehrerer Gene wurde mithilfe des virale 2A Peptids in A. niger untersucht. Dabei wurden drei Gene polycistronisch exprimiert. Zwei dienten der Produktion des Sekundärmetabolits Enniatin. Als drittes Gen wurde das Reportergen Luziferase verwendet. Dadurch wurde untersucht, ob die Position eines Gens innerhalb der polycistronischen Genexpressionskassette einen Effekt hat. Enniatin konnte produziert werden und die Position der Luziferase hatte einen Einfluss. Die Lumineszenz war an Position eins am geringsten und an Position zwei und drei vergleichbar mit der eines die Luziferase monocistronisch exprimierenden Kontrollstammes. Für die Produktion von Enniatinen sind neben D -Hydroxysäuren auch die verzweigten L -Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin nötig. Eine erhöhte Verfügbarkeit dieser Aminosäuren könnte die Produktion von Enniatin steigern. Da der verzweigte Aminosäurestoffwechselweg in A. niger nicht charakterisiert ist, wurden zwei der vorhergesagten Biosyntheseenzyme für Deletionsexperimente ausgewählt, um ihre Funktion zu bestätigen. Es wurde erwartet, dass eine Deletion zu einer Auxotrophie für verzweigte Aminosäuren führt. Dies konnte jedoch nicht erreicht werden. Viele der für A. niger vorhergesagten Sekundärmetabolitgencluster werden unter Standardlaborbedingungen nicht exprimiert. Deshalb wurden verschiedene genetische Strategien zur Aktivierung von zwei Sekundärmetabolitgenclustern untersucht. Ein Cluster ist vermutlich für die Produktion von Aurasperonen verantwortlich, das zweite ist nicht näher charakterisiert. Alle angewandten Strategien führten nicht zu einer Aktivierung des entsprechenden Genclusters. Dies konnte über Northern- und Sekundärmetabolitanalysen nachgewiesen werden. Außerdem wurde das Schlüsselenzym des vermuteten Aurasperongenclusters deletiert. Dieser Stamm war nicht mehr in der Lage Aurasperone zu produzieren, so dass die Notwendigkeit des Schlüsselenzyms für die Produktion von Aurasperonen gezeigt werden konnte.Aspergillus niger is a filamentous ascomycete and industrially used for organic acid as well as protein production. In the past ten years research has also focussed on its secondary metabolism and homologous as well as heterologous production of secondary metabolites was achieved. Different tools to genetically modify A. niger are available. Nevertheless, inducible gene expression systems are scarce and co-expression of multiple genes is technically challenging. Therefore, this dissertation aimed to: i) establish a new gene expression system, ii) express genes polycistronically and iii) activate secondary metabolite gene clusters by different genetic approaches. A bacterial gene regulation system was genetically engineered for use in A. niger by expressing the corresponding regulatory protein and its operator sequence heterologously. This system uses intracellular citrate as an inducer molecule. As a result regulation occurs autonomously, no inducer molecule needs to be added. Different designs of the expression system were analysed using the reporter gene luciferase. However, none of them showed the expected luminescence profile. Therefore, the system needs to be optimised. Co-expression of multiple genes can be achieved using the viral 2A peptide. This system has not been used in A. niger yet. Therefore, three genes were co-expressed using the viral 2A peptide. The aim was not only to test whether the system can be used to produce the secondary metabolite enniatin (which requires the expression of two genes), but also to analyse whether the position of a gene within the polycistronic cassette matters. Therefore, luciferase was included as a reporter gene. The results could show that enniatin was indeed produced and luminescence depended on the position of the luciferase gene. It was lowest at position one. Position two and three showed an equal luminescence compared to the control strain expressing luciferase monocistronically. Enniatins are composed of a branched chain L -amino acid and a D -hydroxyacid. An increased pool of the branched chain amino acids isoleucine, leucine and valine could enhance enniatin production. In order to characterise the branched chain amino acid pathway in A. niger, two enzymes in that pathway were targeted for deletion experiments to verify their function. It was assumed that deletion results in an auxotrophy for branched chain amino acids. This could, however, not be confirmed. The majority of secondary metabolite gene clusters of A. niger are not expressed during standard laboratory growth conditions. Therefore, different genetic strategies were used to activate two secondary metabolite gene clusters. One of them is predicted to produce aurasperones and the other one has not been characterised yet. All strategies failed to activate the gene cluster. This was confirmed by both secondary metabolite analyses as well as Northern analyses. In addition, the core enzyme of the putative aurasperone gene cluster was deleted to prove its involvement in aurasperone production. Upon deletion, the strain did indeed no longer produce aurasperones.EC/FP7/607332/EU/Quantitative Biology for Fungal Secondary Metabolite Producers/QuantFun