Metabolic Engineering einer O-Acetyl-L-Homoserin-Sulfhydrylase und des Met-Biosynthesewegs in Escherichia coli : rückstandsspezifische chemoselektive Konjugation an Azid-funktionalisierten Proteinen

The application of non-canonical amino acids (ncAAs) offers a new approach for the post-translational modification of proteins [1–4]. Especially the incorporation of ncAAs containing different functional groups such as azides, alkynes or olefins, provides a covalent site on the protein. Subsequently the attachment of other small molecules (fluorescent dye, biotin, sugar, PEG, etc.) brings more possibilities for the application of different target proteins [5]. For example, as an analogue of L-methionine (Met), L-azidohomoalanine (Aha) could provide the target protein with an azide group for the further copper (I)-catalyzed azide-alkyne [3+2] cycloaddition (CuAAC) [6] for protein surface modifications. Based on the traditional selective pressure incorporation (SPI) approach, chemically synthesized Aha is fed to the Escherichia coli which is cultured in the media containing only a limited concentration of Met [7]. To overcome the problems of costly material and time consumption, we engineered a robust bacterial expression host capable of a new intracellular biosynthesis. This system combines genetic engineering of the Met metabolic pathway in E. coli for a one-step in-cell production of ncAAs from native and simple precursors, coupled with direct introduction to the protein. In particular, the in vivo biosynthesis of Aha is engineered firstly from L-homoserine to O-acetyl-L-homoserine by introducing direct sulfhydrylation genes from Corynebacterium glutamicum in to the metabolism of E. coli. Next, it is coupled with sodium azide as a nucleophile for intracellular synthesis of Aha. Finally, Aha is charged on to Met-tRNAs and subsequently inserted into different recombinant target protein variants by AUG codon reassignment in the robust Met-auxotroph E. coli strain MDS15A. Similarly to sodium azide, in the same engineered MDS15A strain, allyl mercaptan is coupled as another nucleophile for the biosynthesis of S-allyl-L-homocysteine (Sahc). Furthermore, Sahc is incorporated to target protein by AUG codon reassignment to achieve protein olefin functionalization. The basic feature of our system is that the engineered host’s Met biosynthetic pathway is efficiently diverted towards the production of the desired ncAA by exploiting the broad reaction specificity of recombinant homoserine acetyltransferase from C. glutamicum (cgHSAT; EC 2.3.1.31; metX) and pyridoxal phosphate dependent O-acetyl-L-homoserine sulfhydrylase from C. glutamicum (cgOAHSS; EC 2.5.1.49; metY) [8]. Namely, intracellular Met-biosynthesis in C. glutamicum occurs via homocysteine (direct sulfhydrylation) whereas in E. coli a trans-sulfuration route is present for Met biosynthesis. In the expression experiments, the E. coli host equipped with genes for direct sulfhydrylation (metX and metY) is used as a platform for the synthesis of different Met-analogues as cgOAHSS is tolerant towards the activation of a wide variety of nucleophiles. In this way, the target proteins, for instance barstar, green fluorescent protein and enhanced cyan fluorescent protein, are decorated with Aha or Sahc which are incorporated in place of Met. To achieve economic production of these protein variants, it is necessary to quantify the in-cell precursor amount as well as to optimize the new established metabolic pathway in a simple and efficient way. For this purpose another Met auxotrophic strain Escherichia coli JW3973 has been introduced to determine the amount of intracellular L-homoserine and perform further engineering and optimization of the fermentation procedure. Thereby, a higher cell population is required to increase the yield, it is equally important to optimize the composition of the expression media in order to create a ‘feeding device’ with both (a) improved protein expression yield and (b) robust and better culture growth”.The decoration of protein surface with azide functional group(s) provides a handle for bioconjugation with various alkyne containing ligands via copper (I) catalyzed azide-alkyne [3+2] cycloaddition (CuAAC). The attached ligands bring several novel functions to these surface modified proteins. For instance, as one non-toxic and non-immunogenic biomaterial, polyglycerol dendrimers [101] are concerned as potential replacement for polyethylene glycol (PEG) for therapeutic proteins [102,103]. The attachment of dendrimers to proteins can be achieved in residue-specific manner depending on the number of the AUG codons in the target protein. It brings the protein scaffold better protection in clinical settings without influencing the protein structure or stability; Moreover, as a fluorescent dye, dansyl(propargyl)amine [104] enables the proteins with new fluorescent activity. This methodology can offer a special probe for protein detection, especially in complex system such as cells and tissues. In this study, firstly a lower generation type of poly-glycerol dendrimer with alkyne group called “oligoglycerol dendron propargyl (dOG) generation 2” is specifically attached to azide-containing protein. Both azide functionalized model proteins B* and GFP are subjected to “dendronylation” with dOG by using CuAAC. The level of this conjugation is verified by mass spectrometry. The stability of conjugated B* proteins is scrutinized through circular dichroism, which provides secondary structure signals and thermal unfolding profiles. The second ligand was dansyl(propargyl)amine. Azide-containing B* protein conjugated with dansyl shows a new fluorescent emission upon UV-excitation under fluorescence spectroscopy. Finally, to keep the protein scaffold intact, the CuAAC reaction was further optimized to mild conditions and high efficiency. Together via dOG and dansyl bioconjugation, the applicative potential of azide proteins produced using previously described protocols was fully confirmed.Die Verwendung von nicht-kanonischen Aminosäuren (nkAS) bietet einen neuen Ansatz im Vergleich zur post-translationalen Modifikation von Proteinen [1–4]. Insbesondere ermöglicht der Einbau von nkAS mit funktionellen Gruppen, wie Aziden, Alkinen oder Olefinen das Ausstatten der Proteine mit bioorthogonalen, kovalenten Bindungsstellen. An diesen Positionen können anschließend andere kleine Moleküle (z.B. Fluoreszenzfarbstoff, Biotin, Zucker oder PEG) gekuppelt werden, welche die Verwendbarkeit von Zielproteinen erhöhen können.[5] Beispielsweise kann eine Azid-Funktion durch den Einbau von L-Azidohomoalanin (Aha) als Analogon von L-Methionin (Met) in ein Protein eingeführt werden und anschließend für Proteinoberflächenmodifikationen durch Reaktion mit einem Alkin in einer Kupfer(I)-katalysierten Azid-Alkin[3+2]-Cycloaddition (CuAAC) [6] verwendet werden. Zunächst haben wir in dieser Arbeit basierend auf der traditionellen Selektionsdruck-Einbau(SPI)-Methode, einen Escherichia coli-Stamm in einem Medium mit limitierender Met-Konzentration kultiviert und anschließend mit chemisch synthetisiertem Aha gefüttert.[7] Anschließend haben wir, um die Probleme von teurem Aminosäurematerial und hoher Zeitaufwendung zu umgehen, einen robusten bakteriellen Expressionswirts mit einer neuen intrazellulären Biosynthese entwickelt. Dieses System kombiniert das genetische Engineering des Met Stoffwechselweges in E. coli für die einstufige, intrazelluäre Produktion von nkAS ausgehend von nativen und einfachen Vorstufen mit dem direkten Einbau dieser in vivo synthetisierten nkAS in das Protein. Im Detail beinhaltete der erste Schritt für die engineerte in vivo-Biosynthese von Aha die Einführung eines Acetylierungs-Enzyms aus Corynebacterium glutamicum in den Metabolismus von E. coli um ausgehend von L-Homoserine O-Acetyl-L-Homoserin zu bilden. Der zweite Schritt beinhaltet ein ebenfalls aus Corynebacterium glutamicum stammendes Sulfhydrylierungsenzym, welches den nukleophilen Angriff von Natriumazid an Acetyl-L-Homoserin katalysiert, wodurch Aha gebildet wird. Schließlich wird Aha in dem robusten Met-auxotrophen E. coli-Stamm MDS15A auf die Met-tRNAs geladen und anschließend in verschiedene rekombinante Zielprotein-Varianten durch AUG-Codon-Neuzuordnung eingebaut. Ähnlich zu dem Experiment mit Natriumazid haben wir den gleichen enginneerten MDS15a-Stamm mit Mercaptan als Nukleophil für die Biosynthese von S-allyl-L-Homocystein (Sahc) gefüttert. Hierbei wurde Sahc durch AUG-Codon-Neuzuordnung ins Zielprotein eingebaut, welches zu einer Olefinfunktionalsierung des Proteins führte. Die grundlegende Eigenschaft unseres Systems ist, dass der Met-Stoffwechselweg des engineerten Wirts durch ausnutzen der breiten Rekationsspezifität der rekombinanten Enzyme aus C. glutamicum (Homoserin-Acetyltransferase (cgHSAT; metX) und der Pyridoxalphosphat-abhängigen O-Acetyl-L-Homoserin-Sulfhydrylase (cgOAHSS; metY))[8] effizient in Richtung der Produktion der gewünschten nkAS umgeleitet wird. Die intrazelluläre Met-Biosynthese in C. glutamicum findet über Homocystein statt (direkte Sulfhydrylierung), wohingegen E. coli einen Trans-Sulfurierungsweg für die Met-Biosynthese verwendet. In den Expressionsexperimenten dieser Studie wurde der E. coli-Wirt, welcher mit den Genen für die direkte Sulfhydrylierung (metX and metY) ausgestatted wurde, als Plattform für die Synthese von verschiedenen Met-Analoga verwendet, da cgOAHSS viele verschiedene Nukleophile aktiviert. Auf diese Weise konnten die Zielproteine, beispielsweise Barstar, grün-fluoreszierendes Protein und verbessertes cyan-fluoreszierendes Protein mit Aha oder Sahc an den Met-Positionen modifiziert werden. Um eine ökonomische Produktion dieser Proteinvarianten zu erreichen, ist es sowohl notwendig die Menge der Aminosäurepräkursor zu quantifizieren, als auch die Effizienz des in dieser Arbeit etablierten neuen Stoffwechselweges zu optimieren. Aus diesem Grund wurde ein weiterer Met-auxotropher E. coli-Stamm (JW3973) für die Bestimmung der intrazellulären L-Homoserin-Menge eingeführt und um weiteres Engineeren und Optimieren des Fermentationsprozesses durchzuführen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass zur Erhöhung der Proteinausbeute in gleichem Maße die Erhöhung der Zellpopulation als auch die Zusammensetzung des Expressionsmediums von Bedeutung ist, um eine Fütterungsprozedur zu kreieren, welche a) eine verbesserte Proteinexpressionsausbeute und b) robustes und verbessertes Zellwachstum ermöglicht. Die Ausstattung der Proteinoberfläche mit funktionellen Azid-Gruppen ermöglicht die Biokonjugation mit Alkin-Liganden, z.B. Dansyl(propargy)amin [101] und Polyglycerol-Dendrimeren [102] durch Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin[3+2]-Cycloaddition (CuAAC). Diese Verknüpfung stattet diese oberflächmodifizierten Proteine mit vielen, neuen Funktionen aus. Beispielsweise haben die ungiftigen, nicht immunogenen Polyglyceroldendrimere [101] das Potential Polyethylenglycol (PEG) als Biomaterial für therapeutische Proteine zu ersetzen[102,103]. Die Fusion der Dendrimere mit den Proteinen kann durch einen AUG-Codon basierenden aminosäurerestspezifischen Einbau erreicht werden. Durch die Modifikation wird das Proteingerüst in klinischen Anwendung besser Geschützt ohne hierbei die Proteinstruktur oder –stabilität zu beeinflussen. Desweiteren können Proteinen mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs Dansyl(propargyl)amin [104] mit einer Fluoreszenzaktivität ausgestattet werden. Diese Methodologie kann spezielle Proben für die Proteindetektion generieren, insbesondere für komplexe Systeme wie Zellen und Geweben. In dieser Studie haben wir zunächst Polyglyceroldendrimere einer niedrigeren Generation „Oligoglyceroldendronpropargyl(dOG)generation 2“ spezifisch an Azid-enthaltende Proteine angehängt. Beide Azid-funktionalisierten Modelproteine B* und GFP wurden der „Dendronylierung“ mit dOG durch CuAAC unterworfen. Die Levels der Konjugation wurden durch Massenspektometrie verifiziert. Die Stabiliät der konjugierten B*-Proteine wurde eingehend mittels zirkularem Dichroismus untersucht, welcher die Aufnahme von Sekundärstruktursignalen und thermischen Entfaltungsprofilen ermöglicht. Als zweiten Liganden in dieser Arbeit wurde Dansyl(propargyl)amin verwendet. Mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass das Azid-enthaltende B*-Protein nach Konjugation mit Dansyl eine neue Fluoreszenzemission bei UV-Bestrahlung aufweist. Um das Proteingerüst intakt zu halten, wurde die CuAAC-Reaktion darüberhinaus zu milderen Bedingungen und höherer Effizienz optimiert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die Modifikationen mit dOG und Dansyl das Anwendungspotential von Azidproteinen, welche durch bereits beschriebene Protokolle produziert wurden, eindeutig bestätigt werden konnte