Análisis mutacional del sitio ligante para el activador alostérico AMP de la fosfofructokinasa de mamíferos

Resumen del póster presentado al XXXIV Congreso de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular, celebrado en Barcelona del 5 al 8 de septiembre de 2011.La fosfofructokinasa (PFK) es un enzima clave para el control de la glicolisis, sin embargo poco se conoce sobre las bases moleculares de su función en eucariotas. La identificación de los residuos aminoacídicos pertenecientes a los sitios ligantes y el estudio de su implicación funcional en el enzima de mamíferos se están llevando a cabo por comparación con el enzima bacteriano, de estructura más simple, mediante mutagénesis dirigida en base a que el gen eucariótico se generó por duplicación del procariótico, y su posterior fusión y divergencia. Se ha propuesto que la duplicación del sitio catalítico para MgATP en la mitad Cterminal originó el sitio alostérico para el activador AMP. Para investigar esta propuesta hemos iniciado la mutación sistemática de los residuos potencialmente implicados Phe440, Arg471, Lys475, Lys476 y Phe499 del isozima M humano mediante sustitución por alanina. Los cDNAs mutantes se expresaron en una cepa de levadura carente de PFK, y los enzimas fueron purificados y caracterizados. Únicamente las mutaciones F440A y K476A reducen la activación por AMP, pero no por cAMP. En el doble mutante F440A-K476A se aumenta la Kact para AMP y cAMP en torno a 7 y 3 veces con respecto al enzima salvaje, afectándose también la unión de estos efectores, lo que indica que ambos residuos forman parte del sitio regulador. Adicionalmente hemos identificado que Arg471 pertenece al sitio alostérico para el activador fructosa 2,6-bisfosfato derivado del sitio catalítico duplicado para fructosa 6-fosfato en la mitad C-terminal.Financiado por el MICINN (2008-02364 y 2009-13114).Peer reviewe