Interacción entre receptores de estrógenos, hipoxia, angiogénesis y metabolismo tumoral en cáncer de mama

El cáncer de mama ocupa el primer lugar en incidencia y muerte por neoplasia maligna en mujeres en el mundo occidental. Sin embargo, la gran heterogeneidad de la enfermedad, hace que haya una necesidad creciente de biomarcadores no sólo para el diagnóstico preciso, sino también para el abordaje del paciente que permitan una medicina personalizada y de precisión. En términos generales existen tres factores que influyen notablemente en la agresividad de un tumor mamario. Por una parte, prevalece una fuerte correlación entre la proliferación y el receptor de estrógenos (ER). Por otra parte, la angiogénesis es necesaria para el aporte de nutrientes al tumor y juega así un papel fundamental en la agresividad, en el grado de malignidad y en la posible recurrencia clínica. Y finalmente, es bien conocido que las células cancerosas utilizan un metabolismo alterado en comparación con las células adultas diferenciadas en el organismo. Pero a pesar de que estos elementos se han estudiado de modo individual, las interacciones entre los mismos no han sido exploradas por completo. Mediante la presente tesis doctoral se ha estudiado en profundidad la interacción entre la angiogénesis, el metabolismo tumoral, la hipoxia y los receptores de estrógenos. La hipótesis de partida era que podrían existir diferencias metabólicas relevantes moduladas por el status de los receptores de estrógenos entre tumores aparentemente bien vascularizados dependiendo de la funcionalidad de dicha vascularización (integridad endotelial, permeabilidad endotelial, organización vascular) y la hipoxia correspondiente. La investigación se originó a partir de un estudio exploratorio realizado a partir de la información reportada en bases de datos públicas (ArrayExpress), donde este análisis preliminar de datos de expresión pareció apoyar nuestra hipótesis, al mostrar que el perfil de angiogénesis estaba modulado por la positividad/negatividad del ER. De modo que los experimentos realizados combinaron estos elementos clave: hipoxia, status del ER y estradiol. Para ello, se simuló el ER-α negativo utilizado técnicas de silenciamiento de expresión mediante siRNA sobre una línea celular clásica de hormonodependencia (MCF-7) y se imitó el microentorno tumoral mediante el crecimiento de las células bajo hipoxia moderada (3% O2). Los cambios acontecidos se analizaron y estudiaron a distintos niveles relacionándolos con los marcadores distintivos del cáncer (apoptosis, la migración, la invasión, la proliferación y cambios a niveles de expresión génica y de metabolitos) realizando ensayos de diferente índole tales como: RMN 1H, arrays de expresión, Western-Blot, ensayos MTT, ensayos de migración… Además estos cambios en los perfiles metabólicos y angiogénicos también se estudiaron en biopsias de carácter Luminal A y B, las cuales a pesar de su carácter hormonodependiente y teóricamente menos agresivas también pueden presentar un perfil peor de respuesta a terapia, especialmente esa última. Nuestros resultados han mostrado que existen perfiles angiogénicos modulados por el ER, y que la hipoxia desempeña un papel en la agresividad más fuerte que la inhibición del ER a nivel de perfil biológico global (mayor proliferación, migración, resistencia apoptosis) y que está relacionada fuertemente con cambios metabólicos a distintos niveles. Conjuntamente, la inhibición del ER también es capaz de originar algunos de los cambios que estarían simulando una “pseudohipoxia” y que se relacionarían con el peor pronóstico acontecido en pacientes ante la pérdida de este receptor. En general las diferencias observadas, podemos explicarlos no sólo a partir de perfiles de expresión génica sino también de los metabólicos y así lo confirma nuestro análisis en biopsias Luminales. Todos estos cambios nos hacen diferenciar perfiles de agresividad (angiogénesis) modulados en parte por estado de ER y el microambiente tumoral, donde tales diferencias podrían mejorar la selección de las terapias en los pacientes con subtipos hormonodependientes a partir de un mejor conocimiento de los fenómenos biológicos subyacentes al crecimiento tumoral.Breast cancer has the first ranks in incidence and death due to malignant neoplasm in women in the Western world. Despite the great heterogeneity of the disease, there is an increasing need for biomarkers not only for the precise diagnosis, but also for the patient's approach that allows a personalized medicine and precision. In general terms, there are three factors that influence the aggressiveness of a breast tumor. On the one hand, a strong correlation between proliferation and the estrogen receptor (ER) prevails. On the other hand, angiogenesis is necessary for the supply of nutrients to the tumor and thus, plays a fundamental role in the aggressiveness, degree of malignancy and possible clinical recurrence. And finally, it is well-known that cancer cells use altered metabolism compared to differentiated adult cells in the body. Although these elements have been studied individually, the interactions between them have not been fully explored. The present thesis has studied in depth the interaction between angiogenesis, tumor metabolism, hypoxia and estrogen receptors. The starting hypothesis was that there could be relevant metabolic differences modulated by the status of the estrogen receptors between apparently well vascularized tumors depending on the functionality of such vascularization (endothelial integrity, endothelial permeability, vascular organization) and corresponding hypoxia. The exploratory study from the information reported in the public databases (Array Express), appeared to support our hypothesis by showing that the angiogenesis profile was modulated by the positivity / negativity of the ER. For this reason, the experiments performed combined these key elements: hypoxia, ER status and estradiol. In this way, ER-α negative status was simulated by using siRNA over a classical hormone-dependent cell line (MCF-7). In addition, tumor micro environment was mimicked by growing the cells under moderate hypoxia (3% O2). In a first step, the changes that occurred were analyzed and studied at different levels in relation to the distinctive markers of cancer (apoptosis, migration, invasion, proliferation, and changes in gene expression and metabolite levels) by performing different types of assays such as: 1H NMR and HR-MAS metabolomics, expression arrays, Western-Blot, MTT assays, migration assays ... In a second step, these changes in the metabolic and angiogenic profiles were applied on in luminal biopsies A and B which, despite their hormonal and theoretically less aggressive nature, may also present a worse profile of response to therapy, especially this last one subtype. Our results have shown that 1) there is a specific ER-modulated angiogenic profiles 2) the hypoxia plays a stronger role in aggression than the inhibition of ER at the global biological profile (increased proliferation, migration, apoptosis resistance) which is strongly related with metabolic changes at different levels. Finally, ER inhibition is able to induce some changes that would be simulating a “pseudo hypoxia” and would be related to the worst prognosis in patients with the loss of this estrogen receptor. In general the observed differences, we can explain them not only from gene expression profiles but also from the metabolic ones and this is confirmed by our analysis in luminal biopsies. All these changes make us differentiate aggression profiles (angiogenesis) modulated in part by ER status and the tumor microenvironment, where such differences could improve the selection of therapies in patients with hormone-dependent subtypes from a better understanding of biological phenomena underlying tumor growth