IgG:tä tuottavan solutehtaan suunnittelu hiivassa plasmasolumallia seuraamalla

IgG antibodies are powerful biotherapeutics that are used in the treatment of several severediseases, for example cancer and autoimmune diseases. Specialized cells in the human immunesystem, plasma cells, naturally produce antibodies with high efficiency. However, biotechnologicalproduction methods based on mammalian cell cultures remain inadequate and expensive. The expanding market of antibody biotherapeutics has spurred the aspiration to develop alternativeproduction methods. One potential platform for antibody production is the yeast Saccharomycescerevisiae, which has been successfully engineered to produce a range of products by utilizing the versatile genetic toolkit available for modifying this organism. Plasma cell differentiation depicts a comprehensive molecular model of cellular transformation into an efficient antibody factory, and this model provides a blueprint for genetic engineering. In this thesis, we studied whether the key elements from plasma cells would improve IgG secretion in yeast. First, we modified the yeast ER to mimic the plasma cell ER morphology. Both an increase inER size and an altered shape, achieved by deletion of OPI1 and shape determinant genes, respectively, increased IgG secretion at least 2.4-fold. In addition, these mutants displayed a reduced stress response related to antibody production. We selected the strain with the OPI1 gene deletion for engineering of protein folding, along with the wild-type production strain. Relying on principles of synthetic biology, we created a modular plasmid library of mammalian folding factors shown to interact with IgG. To aid plasmid library creation, we established a new high-throughput cloning method to complement the available synthetic biology tools. Screening of the plasmid library led us to identify GRP170, BiP and FKBP2 as the most potent enhancers of IgG folding and secretion in yeast. We concluded that upregulation of ER-localized PPIase activity is critical for improving IgG titers in yeast. Additionally, we explored transcriptomics data from plasma cell differentiation to find genetargets which would otherwise be overlooked in engineering approaches. Through this datadrivenapproach, we selected seven novel genetic modifications to analyze in yeast. Two of these seven modifications, the overexpression of the genes GOT1 and IRE1 led to significant improvements in IgG secretion, resulting in a 1.6- and a 3.5-fold increase in specific product yields, respectively. However, in the future the emphasis should be in improving the quality of the secreted antibody. This thesis demonstrates that plasma cells are useful cellular models for antibody secretion,also when applied to an evolutionary distant species, such as the yeast S. cerevisiae. The IgGtiters were increased from 40 ng/ml to up to 160 ng/ml, confirming that this yeast is a promisingplatform for future applications of the biotherapeutics industry.IgG vasta-aineita voidaan käyttää tehokkaina biologisina lääkkeinä useiden vakavien sairauksien, kuten syövän ja autoimmuunisairauksien, hoidossa. Plasmasolut ovat ihmisen immuuni-järjestelmän erikoistuneita soluja, jotka luontaisesti erittävät vasta-aineita tehokkaasti. Bioteknologiset nisäkässoluviljelmiin perustuvat keinot vasta-aineiden tuottamiseen ovat kuitenkin hankalia ja kalliita, joten on tärkeää löytää vaihtoehtoisia tuottoalustoja vasta-aineiden kasvavien markkinoiden täydentämiseksi. Yksi näistä mahdollisista tuottoalustoista on Saccharomyces cerevisiae eli leivinhiiva, sillä tätä organismia on onnistuneesti geneettisesti muokattu tuottamaan useita arvokkaita aineita. Plasmasolujen erikoistuminen tehtäväänsä vasta-ainetehtaina tarjoaa kattavan molekyylitason mallin, jota voidaan hyödyntää solujen geneettisessä suunnittelussa. Tässä väitöskirjatyössä tutkimme, voisiko IgG vasta-aineen tuottoa lisätä soveltamalla plasmasolujen piirteitä ja osia hiivan muokkauksessa. Aloitimme endoplasmakalvoston muuntelusta yrittäen jäljitellä plasmasolujen endoplasma-kalvoston morfologiaa. OPI1-geenin tai muotoa määrittävien geenien poisto hiivan genomista on todettu johtavan endoplasmakalvoston suurenemiseen ja muodon muutokseen. Näissä deleetio-kannoissa IgG:n eritys kasvoi vähintään 2,4-kertaiseksi sekä vasta-aineen tuottoon liittyvä stressireaktio pieneni. Valitsimme OPI1-deleetiokannan sekä villityyppi-tuottokannan proteiinin laskostumisen suunnitteluun. Synteettisen biologian periaatteita mukaillen loimme modulaarisen plasmidikirjaston nisäkkäistä peräisin olevista laskostumistekijöistä, joiden on todettu vaikuttavan vasta-aineiden muodostumiseen. Plasmidikirjaston luomisen yhteydessä kehitimme uuden tehokkaan kloonausmenetelmän, joka täydentää synteettisen biologian työkaluvalikoimaa. Plasmidikirjaston seulonnasta tunnistimme laskostumistekijöiden GRP170, BiP ja FKBP2 parantavan IgG:n laskostumista ja eritystä eniten. Huomasimme endoplasmakalvostoon liittyvän PPIaasi-aktiivisuuden olevan keskeinen rajoite vasta-aineiden tehokkaaseen eritykseen hiivassa. Kokeilimme myös transkriptomiikkadatan hyödyntämistä geenikohteiden löytämisessä. Plasma-solujen erikoistumista kuvaavaa dataa käyttäen valitsimme seitsemän uutta geneettistä muutosta, jotka muissa suunnittelustrategioissa jäisivät huomiotta. Kaksi näistä seitsemästä muutoksesta, GOT1- ja IRE1-geenien yliekspressio, lisäsivät IgG:n eritystä merkittävästi, johtaen 1,6- ja 3,5-kertaiseen tuottoon. Vasta-aineen laadun parantamiseen pitäisi kuitenkin keskittyä enemmän. Tämä väitöskirjatyö osoittaa plasmasolujen olevan hyödyllisiä vasta-aine-erityksen solumalleja myös evolutiivisesti kaukaiseen lajiin kuten leivinhiivaan sovellettaessa. IgG:n loppukonsentraatio nousi 40 ng/ml:sta 160 ng/ml:aan, vahvistaen, että tämä hiiva on lupaava alusta biolääketeollisuuden tulevaisuuden sovelluksiin