Tutkimus hydrofobiinin käyttäytymisestä ilma-vesi rajapinnalla

In this master’s thesis, I studied how two different class II hydrophobins HFBI and HFBII from Trichoderma reesei fungus behave at air-water interface and how the addition of a fusion protein DCBM-RLP-HFBI influences their behaviour. Hydrophobins are a family of small molecular weight proteins produced by filamentous fungi that are highly surface-active. As a polypeptide, hydrophobin consists of several amino acids. Hydrophobins have a unique sequence of amino acids; almost all of them have eight cysteine amino acid residues. These eight cysteine amino acids create four disulphate bonds between each other. In addition, amino acids that are on the surface of the molecule and have a hydrophobic nature aggregate almost at the same end on the surface of the molecule. This makes the hydrophobin molecule to possess an amphiphilic nature as it has a hydrophobic patch in a hydrophilic body. Subsequently, hydrophobin molecules adsorb at air-water interface and form an amphiphilic membrane. In my research, I focused on clarifying the properties of this amphiphilic membrane. Two kinds of class II hydrophobins HFBI and HFBII from Trichoderma reesei fungus, and fusion protein (DCBM-RLP-HFBI), which is consist of one molecule of HFBI hydrophobin and two cellulose domains connected by long chain of resilin-like polypeptide, were studied to achieve a deeper understanding about their behaviour at air-water interface. The study is divided into two parts: background literature and experiments. Background literature was discussed with an emphasis on basic structures of hydrophobins, the behaviour of hydrophobins at interface and their properties and biological roles. Then experiments were done on the two kinds of hydrophobins and the fusion protein via two different investigation methods, i.e. droplet shape analysis (DSA) and surface dila- tational rheology (SDR). Droplets consisting of hydrophobin HFBI, HFBII or their mixtures that dropped on parafilm and micro- fabricated substrates were studied. The behaviour of droplets was followed by taking pictures and measuring the areas, volumes, contact areas between the droplets and substrates and the flattened areas on the top of droplets. The changes in the pictures were analysed as a function of time. In addition, the behaviours of fusion protein DCBM-RLP-HFBI and pure water were analysed in the same manner. The same solutions that utilized in droplet shape analysis were utilized in surface dilatational rheology experiments. The surface tension of air bubble that created inside the solution and the elastic modulus of hydrophobin layer that self-assembled at interface were measured. From a biomimetic point of view, a significant difference was assumed to be in the properties of the layers of HFBI hydrophobin and HFBII hydrophobin, although they are quite similar and produced by the same fungus. The droplet shape analysis showed that both of hydrophobin molecules produce an amphiphilic film and the surface of droplets tends to remain constant. Surface dilatational rheology experiments showed a significant difference between the degree of elasticity of HFBI and HFBII hydrophobin layers. The HFBII layer was clearly elastic even at a high hydrophobin concentration, whereas the applied study (SDR) failed to measure the elasticity of the HFBI layer.Tässä diplomityössäni selvitin, miten kaksi eri II-luokan hydrofobiinia käyttäytyvät ilma-vesi – rajapinnalla ja miten fuusioproteiinin lisääminen vaikuttaa niiden käyttäytymiseen. Hydrofobiinit ovat ryhmä rihmasienien tuottamia pienimoolimassaisia ja erittäin pinta-aktiivisia proteiineja. Polypeptidinä hydrofobiini koostuu useista aminohapoista. Hydrofobiineilla on ainutlaatuinen aminohapposekvenssi; lähes kaikissa on kahdeksan kysteiiniaminohappoa. Nämä kahdeksan kysteiiniaminohappoa muodostavat keskenäänneljä disulfidisidosta. Lisäksi ne aminohapot, jotka ovat molekyylin pinnalla ja joilla on hydrofobinen luonne, sijaitsevat samalla puolella molekyyliä. Tämä tekee hydrofobiinimolekyylistä ominaisuuksiltaan amfifiilisen, koska pieni osa muuten hydrofiilisestä pinnasta on hydrofobinen. Tämän seurauksena hydrofobiinimolekyylit adsorboituvat ilma-vesi rajapintaan ja muodostavat amfifiilisen kalvon. Tutkimuksessani keskityin selvittämään tämän amfifiilisen kalvon ominaisuuksia. Tutkin HFBI ja HFBII – nimisiä hydrofobiineja, jotka ovat molemmat Trichoderma reesei sienen tuottamia. Tutkimani fuusioproteiini DCBM-RLP-HFBI koostuu yhdestä HFBI-hydrofobiinimolekyylistä ja kahdesta selluloosaan sitoutuvasta domeenista, jotka oli liitetty yhteen pitkäketjuisella, resiliinin kaltaisella polypeptidillä. Tutkimus on jaettu kahteen osaan: taustakirjallisuuteen ja empiirisiin kokeisiin. Taustakirjallisuudessa käsiteltiin ensisijaisesti hydrofobiinien olemusta eli perusrakenteita, käyttäytymistä rajapinnassa sekä biologista toimintaa. Suoritin kokeita kahdella erilaisella hydrofobiinilla ja yhdellä fuusioproteiinilla käyttäen kahta eri tutkimusmenetelmää; pisaranmuotoanalyysiä (droplet shape analysis, DSA) sekä pinnan laajenemisreologiaa (surface dilatational rheology, SDR). Kokeissa tutkin pisaroita, jotka koostuivat hydrofobiineista HFBI, HFBII tai niiden seoksista, jotka pipetoin parafiinille ja mikrovalmisteisille substraateille. Pisaran käyttäytymistä seurattiin ottamalla kuvia ja mittaamalla pisaroiden pinta-alat, tilavuudet ja kosketuspinnat pisaroiden ja substraattien välillä, sekä pisaroiden yläpuolella litistyneiden alueiden pinta-alat. Kuvien muutokset analysoitiin ajan funktiona. Lisäksi fuusioproteiinin DCBM-RLP-HFBI:n ja puhtaan veden käyttäytymistä analysoitiin samalla tavalla. Tutkin pinnan laajentumiseen liittyvillä reologiamittauksilla liuoksen sisään muodostuneen ilmakuplan pintajännitystä ja hydrofobiinikalvon elastisuutta. Käytin mittauksissa samoja liuoksia kuin pisaranmuotoanalyysissä. Biomimeettisestä näkökulmasta tarkastellen merkittävän eron oletettiin olevan HFBI-hydrofobiinin ja HFBII-hydrofobiinin kerrosten ominaisuuksissa, vaikka ne ovat melko samankaltaisia ja saman sienen tuottamia. Ensimmäinen tutkimusmetodini eli pisaranmuotoanalyysi (SDA) osoitti, että molemmat tutkimani hydrofobiinit muodostavat amfifiilisen kalvon ja pisaroiden pinta-alat pyrkivät pysymään vakiona. Jälkimmäistä tutkimusmenetelmää käytettäessä (SDR) onnistuttiin sen sijaan vahvistamaan hypoteesini hydrofobiinien erilaisuudesta; pinnan laajentumiseen liittyvät reologiset kokeet osoittivat huomattavan eron HFBI- ja HFBII-hydro- fobiinikalvojen elastisuusasteiden välillä. HFBII-kerros oli selvästi elastinen myös korkeassa hydrofobiinipitoisuudessa, kun taas HFBI-kalvon elastisuutta menetelmällä ei onnistuttu mittaamaan lainkaan