Molecular effects of continuous positive airway pressure therapy in patients with obstructive sleep apnea: a proteomics approach

Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017Obstructive sleep apnea (OSA) is a common public health concern in many countries, including Portugal, causing deleterious effects on metabolic and cardiovascular health. There are still, however, gaps in scientific and clinical knowledge in this field. Continuous positive airway pressure (CPAP) is considered the first line treatment in OSA, reducing co-morbidities and associated societal consequences such as accidents and cognitive impairment. However, residual sleepiness may persist in some patients and most chronic consequences of OSA may not be fully reversed by CPAP treatment. Therefore, studies are needed to estimate the reversible effects of CPAP (differences pre- to post-CPAP treatment) and irreversible effects of OSA, in other words, estimate the difference between patients with non-treated OSA and patients after effective treatment, when compared to controls. The objective of this study was to evaluate, using a proteomic approach, the molecular effect of the therapeutic benefit and/or side effects of continuous positive airway pressure treatment in red blood cells of OSA patients with comorbidities, namely diabetes. Notwithstanding the focus on RBCs, plasma samples were also further analyzed to make the results more robust. The results of the study have shown that PRDX2 is highly modulated in OSA patients with or without diabetes, and is associated with OSA’s severity and metabolic status. We reported higher hyperoxidation of RBC PRDX2 oligomeric forms in diabetic OSA patients, and also higher hyperoxidation of plasma PRDX2 and PRX 1/4 in this same group. CPAP benefits, including glycemic control, may correlate with RBC PRDX2 oligomeric redox-state associated with chaperone activity, and with decrease of plasma PRDXs stress-induced inflammation pathways. PRDX2 is a promising biomarker candidate for OSA severity and metabolic status.O Síndrome da Apneia Obstrutiva do Sono (SAOS) é um problema de saúde pública emergente, comum em muitos países, incluindo Portugal. Esta doença é caracterizada por um colapso das vias aéreas superiores durante o sono, que provoca a diminuição ou interrupção do fluxo de ar, normalmente seguido de um despertar do sono. Como consequência, os pacientes sofrem de fragmentação do sono e sonolência diurna excessiva, tendo inúmeras repercussões no dia-a-dia. Além destas, a SAOS pode originar complicações graves, de natureza cardiovascular e metabólica. Entre outras complicações pode-se salientar hipertensão arterial, hipertensão pulmonar, insuficiência respiratória, arritmias e acidentes vasculares cerebrais. Os principais factores de risco para esta doença são a idade, obesidade, género, consumo de álcool e tabagismo. Além de um distúrbio grave do sono, a SAOS é também uma doença de stress oxidativo. O stresse oxidativo surge quando ocorre uma diminuição da capacidade antioxidante, e um excesso de produção de espécies reactivas de oxigénio e/ou de nitrogénio. Apesar de os radicais livres possuírem um papel importante na regulação de vias de sinalização fundamentais para inúmeras funções celulares, quando há excesso de produção destas formas reactivas, estas podem causar danos em lípidos, proteínas e ácidos nucleicos, afectando diversos mecanismos celulares e fisiológicos. Assim, os repetidos eventos apneicos caracterizados pela hipóxia intermitente induzida pela SAOS estão na base de danos moleculares que, ao longo dos anos, podem revelar-se irreversíveis. Existem várias medidas terapêuticas para a SAOS, contudo o tratamento de eleição é o CPAP (do inglês Continuous Positive Airway Pressure). Este método consiste na aplicação de uma pressão aérea positiva contínua por um ventilador, que é transmitida ao paciente através de uma máscara nasal, mantendo a via aérea permeável e permitindo um fluxo aéreo contínuo. A utilização do CPAP possibilita uma melhoria clínica imediata, quando usado regularmente, melhorando assim a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, as consequências crónicas derivadas da SAOS podem não ser totalmente revertidas pelo tratamento com CPAP. Assim, é importante compreender os mecanismos moleculares que estão na base da SAOS, para poder melhor compreender os benefícios do CPAP, que podem contribuir para o desenvolvimento de novas terapias para esta doença. Os glóbulos vermelhos, sendo as células responsáveis pelo transporte de oxigénio às diferentes regiões e órgãos do corpo, são considerados uma fonte de inflamação sistémica que pode conduzir a doenças metabólicas, tais como obesidade, resistência à insulina e hipertensão, patologias reconhecidas como inerentes à SAOS. Estudos recentenmente desenvolvidos do Laboratório de Proteómica do INSARJ tiveram como objectivo analisar o proteoma de glóbulos vermelhos em doentes com SAOS, bem como os efeitos moleculares do CPAP nos glóbulos vermelhos destes doentes, com o intuito de encontrar potenciais biomarcadores para diagnóstico e/ou monitorização da doença. Foi reportado pelos autores que diversas proteínas se encontravam diferencialmente expressas nos doentes com SAOS e após o tratamento CPAP, sendo a Peroxirredoxina II (PRDX2) uma das consideradas mais relevantes para o estudo. A PRDX2 é a terceira proteína mais abundante nos glóbulos vermelhos, sendo por isso fundamental para a sua sobrevivência. As PRDXs possuem funções importantes na célula. Além da sua função peroxidática, que ajuda a combater stress oxidativo através da degradação do peróxido de hidrogénio, actuam em vias de transdução de sinal, e possuem também actividade chaperone, dependendo da sua estrutura redox-oligomérica, sendo por isso importantes na protecção dos glóbulos vermelhos contra stresse oxidativo. Estudos desenvolvidos no Laboratório de Proteómica do INSARJ anteriormente mencionados, mostraram que as formas monomérica e dimérica desta enzima antioxidante PRDX2 se encontravam significativamente hiperoxidadas nos glóbulos vermelhos de doentes com SAOS, principalmente durante a manhã, sugerindo a presença de stresse oxidativo severo que por sua vez leva a uma homeostasia antioxidante alterada, nos glóbulos vermelhos destes pacientes. Seis meses de tratamento com CPAP diminuíram esta hiperoxidação e originaram formas multiméricas hiperoxidadas, associadas à função chaperone da PRDX2, e descritas como estruturas protetoras que ajudam a aumentar a resistência ao stresse celular. Os níveis de PRDX2 oxidada correlacionaram-se com parâmetros polisomnográficos e metabólicos, nesses pacientes. Portanto, o estado redox / oligomérico da PRDX2 nos glóbulos vermelhos tem sido proposto por esses autores como promissor candidato a biomarcador para gravidade da SAOS e monitorização do tratamento. Assim, o objetivo deste trabalho consiste na validação da PRDX2 como potencial biomarcador, tendo como alvo de estudo, além da SAOS, a comorbidade diabetes, e os efeitos moleculares do tratamento CPAP nos glóbulos vermelhos destes pacientes. Para este efeito decidimos usar um cohort maior do que o utilizado nos estudos anteriores, composto por um grupo controlo (n = 18 em que dois são diabéticos), um grupo de pacientes SAOS não tratados (n = 18 em que três são diabéticos), e o mesmo grupo de doentes SAOS após seis meses de tratamento CPAP. Os resultados deste estudo corroboram com os anteriores. Verificou-se que, no geral, a hiperoxidação da PRDX2 nos glóbulos vermelhos é mais elevada em pacientes SAOS, e diminui após seis meses de tratamento CPAP. Contudo, isto só acontece em pacientes SAOS não diabéticos. Após seis meses de tratamento CPAP, os pacientes SAOS com diabetes não revelam uma diminuição da hiperoxidação da PRDX2. Além disto, verificou-se o aparecimento de formas multiméricas hiperoxidadas após o tratamento CPAP, principalmente em pacientes não diabéticos. Estudos de correlação revelaram que os níveis de formas monoméricas e diméricas da PRDX2 correlacionam positivamente com prarâmetros do sono, nomeadamente RDI, ODI, T90, enquanto as formas multiméricas hiperoxidadas correlacionam positivamente com parâmetros metabólicos como a glicémia e hemoglobina glicada, sugerindo que na presença de hipóxia induzida pela SAOS não tratada, estes pacientes podem ter menor capacidade de produzir estruturas multiméricas potetoras na resposta a um aumento de níveis de glucose no sangue, capacidade que pode ser recuperada com o tratamento CPAP. Analisando estes resultados, considerámos pertinente fazer uma experiência semelhante em amostras de plasma, utilzando o mesmo cohort, para robustecer o estudo da PRDX2 nestes doentes. O estudo revelou formas oligoméricas diferente das encontradas nos glóbulos vermelhos. Contudo, o estado oligomérico da enzima corrobora com os resultados anteriores: há um amento da quantidade de PRDX 2 em pacientes com SAOS, com ou sem diabetes, e uma diminuição após seis meses de tratamento CPAP, sendo que esta diminuição é significativa em pacientes não diabéticos. Além disto verificámos que os níveis das formas hiperoxidadas correlacionam positivamente com parâmetros relativos ao metabolismo glicolítico como glicémia, hemoglobina glicada e HOMA-IR. Após o tratamento CPAP estas correlações deixaram de se verificar, excluindo o grupo de pacientes SAOS com diabetes, que as manteve. Assim, podemos dizer que o estado redox/oligomérico da PRDX2 pode ser considerado um potencial biomarcador para a severidade da SAOS e controlo do tratamento CPAP. Contudo, será necessário recorrer a outro tipo de abordagens que permitam estudar a fundo a PRDX2, nomeadamente as modificações pós traducionais desta enzima, e a sua relação com a SAOS e parâmetros metabólicos dos pacientes