Proteinuria-associated renal injury and the effects of intervention in the renin-angiotensin-aldosterone system

Bij gezonde mensen gaat de nierfunctie met het ouder worden langzaam achteruit. Bij patiënten met een nierziekte die gepaard gaat met eiwitverlies in de urine (proteïnurie) is dit proces versneld, en kan uiteindelijk eindstadium nierfalen ontstaan. In dat stadium zijn de nieren niet meer in staat hun belangrijkste functies - verwijderen van afvalstoffen en overtollig vocht uit het lichaam - te vervullen en wordt dialyse (kunstnierbehandeling) of niertransplantatie noodzakelijk. De behandeling van nierpatiënten is er dan ook op gericht om eindstadium nierfalen te voorkomen. De nier en bestaan elk uit ongeveer 1 miljoen filtratie-eenheden: de nefronen. Elk nefron bestaat uit een glomerulus – een bloedvatenkluwen – met daaromheen een membraan, de glomerulaire basaalmembraan. De urine wordt gevormd door filtratie van het bloed door de wand van deze bloedvaatjes en de glomerulaire basaalmembraan, en daarna via kleine buisjes (tubuli) afgevoerd naar het nierbekken en de blaas. Alvorens de urine het nierbekken bereikt, worden door de cellen die de wand van de tubuli vormen, grote hoeveelheden water en stoffen die voor het lichaam behouden moeten blijven, opgenomen en naar de bloedbaan terug getransporteerd. De tubuli vormen samen met het omringende bindweefsel en bloedvaatjes het interstitium. Door de filtratie-eigenschappen van de glomerulaire basaalmembraan komen er normaal gesproken in de urine geen groot-moleculaire stoffen, zoals eiwitten, terecht. Bij beschadiging van de glomerulaire bloedvaatjes of de basaalmembraan, kan er toch lekkage van eiwitten naar de urine ontstaan. Als dit een grote hoeveelheden is (meer dan 2 gram per dag) spreken we van proteïnurie, bij kleine hoeveelheden (minder dan 300 mg per dag) van micro-albuminurie genoemd. Bij dergelijke eiwitlekkage zullen de cellen in de tubulus-wand proberen het eiwit terug te winnen, door het op te nemen in de cel. Bij geringe eiwitlekkage geeft dit niet direct problemen, maar bij grote hoeveelheden - zoals bij veel nierziekten - leidt dit tot een ontstekingsreactie van het tubulo-interstitium, die tot verdere nierschade, en daardoor tot een vicieuze cirkel van progressief nierfunctieverlies leidt. Behandeling van het eiwitlek is dan ook, samen met bloeddrukbehandeling, een van de belangrijkste peilers in de behandeling ter voorkoming van progressieve nierschade. Medicijnen die ingrijpen op het renine-angiotensine-aldosteron systeem (RAAS) (zie ook schema in hoofdstuk 1) zijn daarbij momenteel de meest effectieve geneesmiddelen. De effecten van het RAAS komen voor een groot deel tot stand via angiotensine II, een stof die zowel in de nier als elders in het lichaam een bloedvatvernauwend effect heeft, de zoutterugresorptie in de tubuli stimuleert, en een rol speelt bij het ontstaan van fibrose (verbindweefseling) van de glomerulus en het tubulo-interstitium. Daarnaast stimuleert angiotensine II het hormoon aldosteron dat eveneens de zoutterugresorptie stimuleert, en een rol heeft in het ontstaan van fibrose. Angiotensine-converting enzyme (ACE) remmers zorgen voor een verminderde aanmaak van angiotensine II. Angiotensine II type 1 antagonisten (AT1-A) zorgen ervoor dat angiotensine II niet kan binden aan de receptor, waardoor de bovengenoemde effecten niet plaatsvinden. Aldosteron-antagonisten remmen de binding van aldosteron aan de receptor. Klinisch kan het effect van deze medicijnen worden gemeten aan de daling van de bloeddruk en van de proteïnurie; op de lange termijn vertraagt deze behandeling de achteruitgang van de nierfunctie. Helaas heeft een deel van de patiënten onvoldoende baat bij de therapie zodat uiteindelijk toch nierfalen ontstaat. We spreken dan van therapie-resistentie. De mechanismen die aan die therapie-resistentie ten grondslag liggen zijn niet goed bekend. Toch is het belangrijk om hier meer inzicht in te krijgen, omdat daarmee de basis gelegd kan worden voor de ontwikkeling van nieuwe, effectievere, vormen van nierbeschermende therapie. Het lijkt een logisch uitgangspunt dat factoren binnen in de nier een hoofdrol spelen bij het al of niet aanslaan van therapie. Een konkrete aanwijzing hiervoor komt uit een studie in een kleine groep patiënten die een niertransplantatie hadden ondergaan, en die wegens eiwit in de urine werden behandeld met de ACE remmer fosinopril. Bij alle patiënten was al eerder een nierbiopsie gedaan. Fosinopril bleek minder effectief naarmate er voor de start van de behandeling meer tubulo-interstitiële nierschade aanwezig was, zo werd achteraf (retrospectief) vastgesteld. Op basis van deze studie was onze hypothese dat de mate van tubulo-interstitiële nierschade die aanwezig is voor de start van therapie een belangrijke rol speelt in het al of niet aanslaan van RAAS-blokkade bij de nierpatiënt. Bij de mens is dat echter moeilijk verder te onderzoeken, omdat daarvoor nierweefsel nodig is dat – bij alle patiënten – op gestandaardiseerde wijze verkregen is voor aanvang van therapie. Om ethische redenen is een dergelijke studie-opzet moeilijk haalbaar, daarom hebben wij onze studies uitgevoerd in een diermodel, adriamycine nefropathie, waarin de vereiste standaardisatie wel goed mogelijk is. Adriamycine nefropathie is een experimentele nierziekte die wordt opgewekt door bij ratten eenmalig een dosis adriamycine (een chemotherapeuticum) in te spuiten. Daardoor ontstaat in de nier een eiwitlek dat in de loop van een aantal weken ernstiger wordt, met stabilisatie na ongeveer 6 weken, waarna zich onder invloed van de proteïnurie geleidelijk progressieve structurele nierschade ontwikkelt. Dit kenmerkende beloop maakt het adriamycine model goed geschikt om de effectiviteit van proteïnurie-verlagende behandeling te bestuderen. In onze studies werd bij de ratten, voorafgaand aan de start van de behandeling, onder narcose een klein stukje nierweefsel operatief weggenomen voor onderzoek. Nadat de dieren hersteld waren van de operatie werd de behandeling gestart, en het korte en lange termijn effect daarvan bestudeerd, en geanalyseerd voor wat betreft het verband met de eventuele afwijkingen in het stukje weggenomen weefsel. In de studie in hoofdstuk 2 laten we in dit diermodel zien, dat factoren in het nierweefsel inderdaad voorspellend zijn voor het al of niet aanslaan van de therapie met ACE-remming. De aanwezigheid van bepaalde ontstekingskenmerken in het tubulo-interstitium, vooral de aanwezigheid van myofibroblasten, voorspelde een slechtere anti-proteïnurische respons op de ACE-remmer, zowel op de korte als de lange termijn, en meer structurele nierschade op de lange termijn. De aanwezigheid van myofibroblasten duidt op ontstekingsactiviteit; die ontstekingsactiviteit speelt een rol bij weefselreparatie, maar leidt daarbij – als de schadeprikkel ernstig of chronisch is – ook tot fibrose (verbindweefseling). Myofibroblasten ontstaan uit fibroblasten (steuncellen); als deze zich onder invloed van schadeprikkels gaan vermenigvuldigen krijgen ze andere eigenschappen en brengen dan gladde spiercel actine (α-smooth muscle cell actin) tot expressie. Daardoor zijn ze met een speciale kleuring in het weefsel herkenbaar, we noemen ze dan myofibroblast. (Myo)fibroblasten zijn in staat om bindweefsel aan te maken, en overmatige productie van bindweefsel leidt tot fibrose. Blijkbaar is de mate waarin dit proces actief is, een factor die de effectiviteit van de ACE-remmer vermindert. Deze bevinding kan van groot belang zijn voor het ontwerpen van meer effectieve behandelingsstrategieën, vooral omdat dit afwijkingen betreft die vroeg in het beloop van nierschade optreden, waarbij met het routine microscopisch onderzoek in het nierweefsel nog nauwelijks schade waarneembaar is. Vergelijkbaren, min of meer verborgen, mechanismen zouden bij de mens zeer wel betrokken kunnen zijn bij het matig tot slecht aanslaan van de therapie. Nierschade verloopt immers in zijn vroege fase vrijwel symptoomloos, zodat de meeste patiënten pas onder medische behandeling komen als de nierbeschadigende processen al een poos gaande zijn en de bovengenoemde ontstekingsreactie al actief is. De verdere studies in dit proefschrift richten zich op het identificeren van de factoren betrokken bij de therapie resistentie in het rattenmodel. Welke factoren in de nier zijn de belangrijkste voorspellers van therapie resistentie, en kunnen we factoren identificeren waarop nieuwe therapieën kunnen worden gericht? Daarnaast hebben we onderzocht, of het mogelijk is, om het negatief voorspellende effect van preëxistente ontstekingsactiviteit te doorbreken, met andere woorden: door intensivering van therapie het slechtere beloop om te buigen naar een gunstiger beloop. We hebben een aantal factoren bestudeerd waarvan we een rol verwachtten in therapie resistentie. Omdat in onze eerste studie α-smooth muscle cell actin (α-SMA) expressie de beste voorspeller was, en omdat α-SMA een vroeg kenmerk is van interstitiële fibrose, onderzochten we twee tubulaire factoren die waarschijnlijk een rol spelen in de ontwikkeling van interstitiële fibrose voorafgaand aan de expressie van α-SMA; osteopontin en Kidney injury molecule-1 (Kim-1). Omdat proteïnurie een gevolg is van defecten in de glomerulaire basaal membraan (GBM), hebben we ook twee glomerulaire factoren (heparanase en heparan sulfaten) bestudeerd,. Osteopontin is betrokken bij het aantrekken van ontstekingscellen en komt tot expressie bij vele diermodellen van nierschade. In hoofdstuk 3 laten we zien dat osteopontin aanwezig is in beschadigde proximale tubulus cellen, dat de expressie van osteopontin toeneemt in het verloop van de nierziekte en geassocieerd is met de hoeveelheid proteïnurie. Tijdens behandeling met ACE remmers nam de expressie van osteopontin af, terwijl in onbehandelde dieren de expressie van osteopontin juist verder toenam. Ondanks de daling van osteopontin in de behandelde dieren trad echter geen afname van de interstitiële fibrose op. Osteopontin expressie voorspelde de therapie respons en de afname van de expressie tijdens therapie weerspiegelde de effectiviteit van therapie. Interventie gericht op blokkade van osteopontin zal echter hoogstwaarschijnlijk geen verbetering van de uiteindelijke nierschade geven, omdat osteopontin ook tijdens ACE-remming al daalt, zonder dat zich dat vertaalt in vermindering van de interstitiële fibrose. Ditzelfde geldt eigenlijk ook voor Kidney injury molecule-1 (Kim-1), dat tot expressie komt in beschadigde tubuli na acute nierschade. In hoofdstuk 4 laten we zien dat Kim-1 bij proteïnuriegeïnduceerde nierschade tot expressie komt, en in de urine wordt uitgescheiden. Net als osteopontin daalt Kim-1 tijdens behandeling met ACE remmers en AT1-antagonisten, maar neemt desondanks de interstitiële fibrose toe. Kim-1 zal daardoor waarschijn geen rol spelen in therapieresistentie. Wel is Kim-1 een potentiële biomarker om de effectiviteit van therapie te voorspellen, in deze studie vonden we namelijk dat er een sterke correlatie bestaat tussen de expressie van Kim-1 in de nier en in de urine, en dat Kim-1 expressie ook de anti-proteïnurische respons voorspelt. Dit is een veelbelovend uitgangspunt voor verdere studies bij de mens. In hoofdstuk 5 hebben we in ons diermodel de expressie van heparanase en heparan sulfaten bestudeerd. Heparan sulfaten zijn betrokken bij de integriteit van de glomerulaire basaal membraan (GBM), en verlies van heparan sulfaten leidt tot een verlies van ladings-selectiviteit van de GBM, waardoor er gemakkelijker eiwitten door kunnen lekken. Reactive oxygen species (ROS), zoals zuurstof radicalen, kunnen een verlies van heparan sulfaten veroorzaken. Door te behandelen met ROS-scavengers kan dit gedeeltelijk worden voorkomen. Heparanase, een recent beschreven enzym, is in staat om heparan sulfaat zij-ketens af te breken. In hoofdstuk 5 laten we zien dat heparanase in sterk verhoogde mate tot expressie komt in adriamycine nefropathie, en ook sterk gecorreleerd is met het verlies van heparan sulfaten. We laten ook zien dat behandeling met ROS-scavengers heparanase expressie vermindert. Ook blokkade van de angiotensine II receptor leidt tot een afname van de heparanase expressie. Dus zowel zuurstof radicalen als angiotensine II spelen een rol bij de inductie van heparanase expressie. Naast interventie gericht op angiotensine II en zuurstof radicalen is er in de toekomst een mogelijke rol weggelegd voor behandeling met heparine en heparitinase, die de activiteit van heparanase remmen. Omdat RAAS-blokkade al leidt tot verlaging van heparanase, zal dit echter waarschijnlijk geen oplossing zijn voor therapie resistentie. In hoofdstuk 6 onderzochten we, of de voorspellende waarde van interstitiële schade voor therapie respons beïnvloedbaar is door intensivering van therapie door middel van een laag zout dieet naast de ACE remmer. Een zoutbeperkt dieet is al sinds vele jaren een bekende methode om het effect van ACE remming op bloeddruk en proteïnurie te versterken. We laten in dit hoofdstuk zien, dat deze versterking van de respons ertoe leidt, dat het voorspellend effect van de interstitiële schade wegvalt, met andere woorden: ook in ratten met meer tekenen van interstitiële ontsteking bij de start van de therapie bleek het mogelijk om, door de combinatie met laag zout, de proteïnurie effectief te remmen – terwijl tijdens dezelfde therapie in combinatie met de standaard hoeveelheid zout, of extra veel zout, de ACE remming slechter aansloeg bij dieren met ontstekingsactiviteit voorafgaand aan de therapie. De winst die werd geboekt met het laag zout dieet was het sterkst in dieren met relatief veel ontstekingsactiviteit bij aanvang van de therapie. Deze resultaten zijn belangrijk en hoopgevend: ze geven immers “proof-of-principle” dat het prognostisch effect van de intrarenale afwijkingen geen gefixeerd gegeven is, maar beïnvloedbaar door therapeutische maatregelen. Ook aldosteron speelt een rol in het ontstaan van fibrose, zo is recent gebleken. In hoofdstuk 7 hebben we daarom proteïnurische ratten behandeld met een aldosteron-antagonist naast een ACE remmer. We vonden geen significante verschillen in bloeddruk en proteïnurie ten opzichte van ratten die alleen met een ACE remmer werden behandeld. Wel waren de bloeddruk en proteïnurie in de groep met alleen ACE remmer en in de combinatiegroep lager dan in onbehandelde ratten en ratten met alleen een aldosteron-antagonist. Osteopontin en Kim-1 waren significant verlaagd in de combinatiegroep met ACE remmer en aldosteron-antagonist ten opzichte van onbehandelde ratten, en niet in de groep met alleen een ACE remmer of aldosteron-antagonist. De combinatie ACE remmer met aldosteron-antagonist was dus effectief, maar er was in deze studie geen additioneel effect vergeleken met een ACE remmer alleen, en in hoeverre combinatie van een ACE remmer met een aldosteron-antagonist in staat is om therapie resistentie te doorbreken, zal nader moeten worden onderzocht. Wat zijn nu de belangrijkste conclusies uit dit proefschrift, en hoe zijn die te vertalen naar een betere behandeling van de nierpatiënt? Om te beginnen voorspelt de mate van tubulo-interstitiële ontsteking die aanwezig is bij start van therapie het effect van RAAS blokkade op proteïnurie en de uiteindelijke nierschade. Dit vormt een argument voor vroege opsporing van nierziekte, en snelle behandeling. Ten aanzien van het nut van vroege opsporing zal in de nabije toekomst veel kunnen worden geleerd van de resultaten van het Groningse PREVEND cohort, waarin de waarde van micro-albuminurie als voorspeller van onder andere progressieve nierschade in de algemene bevolking wordt onderzocht. Gelukkig bleek het voorspellend effect op therapie respons in principe modificeerbaar. Ontrafelen van mechanismen van therapie resistentie om betere interventie te kunnen ontwikkelen is daarom zinvol. In ons onderzoek bestudeerden we een beperkt aantal kandidaten, geselecteerd op grond van hun veronderstelde rol bij nierschade. Alle kandidaten hadden weliswaar een voorspellend effect op therapierespons, maar werden door de therapie ook gunstig beïnvloed: een causale factor in therapie resistentie spelen ze daarom waarschijnlijk niet. Uiteindelijk bleek de eerste de eerste factor die bestudeerd is, α-smooth muscle actin (α-SMA), zowel voorspellend te zijn, als ook niet te verbeteren tijdens behandeling; een dergelijk patroon duidt ons inziens op een sleutelrol bij therapie resistentie. De mechanismen van nierschade tijdens behandeling zijn echter uiterst complex. De kandidaat aanpak die hier is toegepast heeft dan ook alle kenmerken van een zoektocht naar de “speld in een hooiberg”. Nieuwe technologieën, zoals micro-array, proteomics en kinomics, kunnen dit bezwaar omzeilen door het screenen van honderden factoren tegelijkertijd – in hun onderlinge samenhang. Een dergelijke aanpak, gecombineerd met het ontwikkelen van non-invasieve biomarkers, zou kunnen leiden tot belangrijke doorbraken bij het ontwikkelen van op mechanismen gebaseerde nierbeschermende therapie, en het monitoren van de effectiviteit daarvan. Onze bevinding dat α-SMA expressie het beloop tijdens therapie voorspelt, en niet daalt tijdens therapie suggereert dat (myo)fibroblasten en factoren die de (myo)fibroblast activeren, belangrijk zijn bij de progressie van nierschade tijdens behandeling met RAAS blokkade. Dit maakt het zinvol om in de toekomst therapie te richten op de (myo)fibroblast zelf en op stoffen die de (myo)fibroblast activeren. Nieuwe behandelingsstrategieën kunnen worden gericht op het proces van omzetting van tubulusepitheelcellen naar myofibroblasten (epithelial to mesenchymal transition, EMT), en ook modulatie van dit proces door middel van stamcellen lijkt potentie te hebben. Hier is echter nog een lange weg te gaan, en op dit moment zijn we nog aangewezen op het beter inzetten van de beschikbare therapieën. Een hoopgevend resultaat uit onze studies is dat met intensivering van de therapie het negatieve prognostische effect van de preëxistente ontstekingsactiviteit in gunstige zin kon worden beïnvloed. Met een op het individu gerichte beleid, waarin de therapie wordt aangepast op geleide van bloeddruk en proteïnurie en eventuele bijwerkingen, en waarin stapsgewijs wordt toegewerkt naar een optimale individuele respons van bloeddruk en proteïnurie valt ook met het nu beschikbare therapeutisch arsenaal nog veel winst te halen