Development and use of engineered peptide deformylase in chemoenzymatic peptide synthesis

Deze thesis beschrijft het onderzoek naar potentieel van het gebruik van het peptide deformylase (PDF) in chemo enzymatische peptide synthese. PDF is geschikt voor selective N terminale deformylatie van bepaalde N-formyl-peptides zonder gelijktijdige hydrolyse van de peptide binding. Door de uitdagingen in het industrieel toepassen van PDF hebben we ons gefocust op het ontwikkelen van een nieuwe purificatie methode om eiwitten met peptidase activiteiten te verwijderen van het PDF. We hebben aangetoond dat het gebruik van enzyme engineering in combinatie met anion-exchange chromatografie een kost efficiënte en industrieel toepasbare purificatie methode is. Andere aspecten zoals het bevorderen van de stabiliteit en het wijzigen van de substraat specificiteit werden also onderzocht. Om de specificiteit van PDF de verbreden, hebben we beslist om verzadigde mutagenesis te gebruiken op molecuulposities die een principiële rol spelen in het herkennen van het substraat. Een analyse metode van E. coli kolonieuse die zorgt voor een snellere selectie van de verbeterde PDF varianten werd ontwikkeld. Verschillende klonen die de nieuwe substraat specificiteit vertonen werden teruggewonnen, gesequenceerd en gedeeltelijk gekarakteriseerd