Structural and functional aspects of site-specific IGF-II mRNA cleavage

Het humane insuline-achtige groeifactor II (IGF-II) speelt een belangrijke rol bij de embryonale ontwikkeling en is geassocieerd met tumorgroei. In gekweekte cellen kan IGF-II diverse effecten veroorzaken, afhankelijk van het celtype waarin het tot expressie komt, zoals groeistimulatie, of juist remming van groei en stimulatie van celdifferentiatie. Terwijl IGF-II een overlevingsfactor is in sommige systemen, induceert het in andere celtypes juist geprogrammeerde celdood (apoptose). IGF-II is dus betrokken bij diverse fysiologische processen, en het is derhalve waarschijnlijk dat IGF-II genexpressie nauwkeurig gereguleerd wordt. Inderdaad vindt er op verscheidene niveaus regulatie plaats; op het niveau van transcriptie (i.e. synthese van het ´boodschapper´ mRNA) door middel van ontwikkelings- en weefselspecifieke activiteit van vier verschillende promoters (i.e. de startplaats van transcriptie)(P1-P4) in het IGF-II gen. Transcriptie vanaf deze promoters leidt tot de vorming van mRNA moleculen die onderling verschillen in de lengte en samenstelling van hun 5´ onvertaalde deel (5-UTR). Dit leidt vervolgens tot verschillen in de translatie (eiwitproductie)-efficiëntie van deze mRNAs en genereert de mogelijkheid om IGF-II expressie te reguleren op het niveau van translatie. Verder is nog bekend dat IGF-II expressie gereguleerd wordt op het niveau van post-translationele bewerking van het IGF-II eiwit. Tijdens de karakterisering van het humane IGF-II gen en de IGF-II mRNAs werd een RNA met een grootte van 1.8 kb gedetecteerd dat co-lineair is met het 3 uiteinde van het IGF-II gen. Dit RNA bleek gevormd te worden door plaats-specifieke endonucleolytische klieving in het 3 onvertaalde deel (3-UTR) van de IGF-II mRNAs en niet door transcriptie vanaf een extra promoter. Het 1.8 kb RNA vertegenwoordigt dus het 3 klievingsproduct; het bestaat uit 3-UTR sequentie en een poly(A) staart, en is zeer stabiel. Klieving van de IGF-II mRNAs genereert ook een 5 klievingsproduct, hetgeen de IGF-II coderende sequentie bevat. Dit 5 klievingsproduct is in tegenstelling tot het 1.8 kb 3 klievingsproduct onstabiel, en wordt niet meer getransleerd. Deze observaties hebben geleid tot de hypothese dat klieving van de IGF-II mRNAs kan fungeren als een additioneel mechanisme om IGF-II genexpressie te reguleren. Begonnen werd met het in kaart brengen van de RNA gebieden die nodig zijn voor in vivo klieving. Hiertoe werden deleties aangebracht in een IGF-II minigen in een expressieplasmide voor transfectie-studies. Deze experimenten toonden aan dat er twee gebieden in de IGF-II 3-UTR nodig zijn voor klieving: een sequentie van 323 nucleotiden rondom de klievingsplaats (element II), en een sequentie van 104 nucleotiden lang dat 2013 nucleotiden stroomopwaards gelegen is (element I). RNA-vouwings-studies lieten vervolgens zien dat element I, dat zeer rijk is aan C-nucleotiden, een stabiele duplex kan vormen met een G-rijk stroomafwaards gelegen gebied in element II. Direct stroomopwaards van de klievingsplaats in element II kunnen twee haarspeldlussen gevormd worden, en de klievingsplaats zelf wordt vooorspeld in een interne lus gelegen te zijn. De RNA gebieden die nodig zijn voor klieving kunnen dus onderverdeeld worden in drie verschillende vouwingsdomeinen: (1) het duplex domein, gevormd door de interactie tussen nucleotiden -2108/-2029 (posities ten opzichte van de klievingsplaats) van element I en +18/+101 van element II, (2) het haarspeldlussen domein in het stroomopwaards gelegen deel (posities -133 tot -7) van element II, en (3) het klievingsplaatsdomein, gevormd door nucleotiden -161/-136 en -6/+16, met de klievingsplaats gelegen in een interne lus. De studies beschreven in dit proefschrift begonnen met pogingen om eiwitten te identificeren die specifiek aan de hierboven beschreven RNA gebieden binden, en zo een rol zouden kunnen spelen bij klieving (Hoofdstuk 3). Hiertoe werden in vitro gesynthetiseerde RNA moleculen die deze gebieden bevatten geïncubeerd met extracten van humane Hep3B cellen, die endogeen IGF-II tot expressie brengen. Dit leverde een specifiek RNA-eiwit complex op dat alleen gevormd wordt in de aanwezigheid van het haarspeldlussen domein. Met behulp van puntmutaties werd de bindingsplaats van het eiwit nauwkeurig in kaart gebracht. Het complex bleek gevormd te worden halverwege de eerste van de twee haarspeldlussen. Wanneer puntmutaties die de eiwitbinding verstoren in het IGF-II minigen werden geïntroduceerd, leverde dit een gematigde reductie in klievingsefficientie op, hetgeen suggereert dat het RNA-eiwitcomplex niet essentieel is voor klieving, maar een modulerende rol in klieving zou kunnen hebben. Hoofdstuk 3 beschrijft ook experimenten waarin het belang van de nucleotiden rondom de klievingsplaats voor klieving werd onderzocht. Verscheidene puntmutaties werden geïntroduceerd rondom de klievingsplaats in het IGF-II minigen, en het effect hiervan op de in vivo klievingsefficientie werd onderzocht. De resultaten tonen duidelijk aan dat de identiteit van specifieke nucleotiden rondom de klievingsplaats zeer belangrijk is, omdat vrijwel alle puntmutaties de klieving ernstig verstoren. De nucleotiden in het gebied direct naast de klievingsplaats van posities 6 tot +16 lijken belangrijker te zijn dan de nucleotiden in het hier tegenover liggende deel van posities -161 tot 136. Interessant genoeg is dit gebied ook duidelijk meer geconserveerd in de evolutie, hetgeen het belang van deze nucleotiden voor klieving onderstreept. Hoofdstuk 4 beschrijft verdere experimenten om meer inzicht te krijgen in de rol van de verschillende RNA vouwingsdomeinen in klieving. Verscheidene deleties werden geïntroduceerd in het haarspeldlussen domein en de effecten op de voorspelde RNA vouwing en in vivo klievingsefficiëntie werden bestudeerd. Hieruit bleek dat alle deleties die de voorspelde RNA vouwing veranderen ook de klieving vrijwel volledig verstoren. Deleties die de wild type RNA vouwing intact laten hebben echter een veel minder drastisch effect op klieving, hetgeen aangeeft dat een specifieke vouwing rondom de klievingsplaats belangrijk is. Het haarspeldlussen domein is op zichzelf niet nodig voor klieving, omdat het geheel verwijderd kan worden zonder de klieving drastisch te verstoren, zolang de vouwing rondom de klievingsplaats maar intact blijft. Dit blijkt uit de resultaten met een mutant (D-135/-18) waarbij het gehele haarspeldlussen domein verwijderd is; deze mutant laat een redelijke klievingsefficientie zien van 47% van de wild type. Een opvallend resultaat echter werd verkregen met een mutant waarbij op een deel van de tweede haarspeldlus na het gehele haarspeldlussendomein verwijderd was (D-135/-72,D-60/-18). Hoewel de klievingsplaats zich bij deze mutant in de voorspelde wild type configuratie bevindt, is de klievingsefficiëntie ernstig verstoord. Dit resultaat gaf aanleiding de computervoorspelling van de RNA-vouwing te verifiëren door middel van biochemische structuuranalyse van het RNA (Hoofdstuk 4). De resultaten van deze studies suggereren dat zowel in het wild type RNA als in mutant D-135/-18 de nucleotiden in de lus rondom de klievingsplaats niet ongepaard zijn, maar betrokken bij niet-Watson-Crick interacties, hetgeen een specifieke conformatie genereert. In mutant D-135/-72,D-60/-18 echter, gedragen deze nucleotiden zich als vrij in oplossing. Deze resultaten suggereren dat een specifieke conformatie, gevormd door niet-Watson-Crick interacties, belangrijk is voor klieving. In overeenstemming met deze hypothese werd gevonden dat puntmutaties rondom de klievingsplaats die de klieving verstoren ook de conformatie rondom de klievingsplaats veranderen in tegenstelling tot mutaties die geen effect hebben op klieving. Hoofdstuk 5 laat experimenten zien die uitgevoerd zijn om meer inzicht te verkrijgen in de fysiologische functie van klieving van IGF-II mRNA. De kinetiek van klieving en de rol van klieving in de afbraak van IGF-II mRNA en eiwitproductie werd getest met behulp van IGF-II constructen onder controle van een tetracycline-induceerbare promoter. De niveaus van het IGF-II mRNA en het 3´ klievingsproduct werden bepaald door Northern blot analyse. Na inductie van transcriptie werd een snelle toename gezien van de niveaus van het IGF-II mRNA; de niveaus van het 3´ klievingsproduct begonnen pas geruime tijd later toe te nemen, hetgeen aangeeft dat klieving een traag proces is. In het omgekeerde experiment waarbij de transcriptie werd geremd, werd de afbraaksnelheid van wild type IGF-II mRNA vergeleken met de afbraaksnelheid van mutant IGF-II mRNA dat niet meer gekliefd wordt. Beide mRNAs werden met dezelfde snelheid afgebroken. Ook op het niveau van eiwitsynthese werd geen significant verschil gezien tussen het wild type IGF-II mRNA en de gemuteerde versie. Deze resultaten laten zien dat in het gebruikte testsysteem klieving een gering effect heeft op mRNA afbraak en ook op eiwitsynthese. Regulatie van klieving onder invloed van externe factoren werd onderzocht in humane Hep3B cellen, die endogeen IGF-II tot expressie brengen en het mRNA klieven. Het effect van verscheiden externe factoren op de efficientie van klieving werd getest. De invloed van trichostatine A (TSA), een histon deacetylase remmer, dexamethason, een synthetisch glucocorticoïde, aan- of afwezigheid van serum (groeifactoren) in het medium, en celdichtheid werden onderzocht. De verkregen resultaten suggereren dat TSA, dexamethason, en serum geen invloed hebben op klieving. Celdichtheid echter, heeft wel effect op klieving; bij een toename van de celdichtheid werd een toename van de niveaus van het 3´ klievingsproduct waargenomen, terwijl de niveaus van het volle lengte IGF-II mRNA gelijkbleven of afnamen, afhankelijk van de frequentie van medium verversing. We hebben dus waargenomen dat klieving in Hep3B cellen gereguleerd wordt afhankelijk van de dichtheid van de cellen. De betekenis van de toename van klieving bij hoge celdichtheid is echter niet duidelijk. De ongebruikelijke stabiliteit van het 3´ klievingsproduct, die waarschijnlijk veroorzaakt wordt door de geconserveerde G-rijke sequentie aan het 5´uiteinde, maakt het aantrekkelijk te speculeren dat dit RNA wellicht een intrinsieke functie vervult in de cel. Het zal interessant zijn deze mogelijkheid experimenteel te testen