Development of a baculovirus insecticide exploiting the Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein

<p>Een belangrijk deel van de schade in land-, tuin- en bosbouw wordt veroorzaakt door vraat van insekten. Om deze schade te beperken zijn er de afgelopen decennia op grote schaal chemische bestrijdingsmiddelen ingezet. Het grootschalige gebruik van deze insekticiden resulteerde echter in selectie van resistente insekten, waardoor vervolgens meer van deze insekticiden moest worden toegediend. Het gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen in het algemeen leidde tot een onaanvaardbare belasting van het milieu, hetgeen de overheid heeft genoopt het gebruik van deze middelen sterk te beperken en het onderzoek naar milieuvriendelijke alternatieve beheersmaatregelen sterk te stimuleren. Eén van de alternatieven is het gebruik van virussen die insekten kunnen doden.</p><p>Baculovirussen zijn specifiek voor geleedpotigen, waartoe ondermeer insekten behoren. Zij vormen potentieel een veilig en biologisch-verantwoord alternatief. Deze virussen hebben echter een aantal belangrijke nadelen. Vanwege hun specificiteit kunnen ze maar tegen een beperkt aantal insekten worden ingezet. Dit is een belangrijk economisch nadeel. Met een specifiek baculovirus kunnen slechts één of enkele insektenplagen bestreden worden en dit garandeert slechts een kleine omzet. Desondanks is recentelijk een baculovirus, onder de naam Spod-X ^R, met succes op de Nederlandse markt gebracht om de Floridamot, die resistent is tegen vrijwel alle toegelaten chemisch insekticiden, in de bloementeelt te bestrijden. Een tweede belangrijke belemmering voor een effectief gebruik van baculovirussen als insektenbestrijdingsmiddel, is het feit dat baculovirussen zich relatief langzaam vermenigvuldigen in het insekt. Het duurt daarom minstens nog een week eer de aangetaste insekten ophouden met eten als gevolg van de virusinfectie. In deze periode kan het gewas nog zeer veel (vraat)schade oplopen. Doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was te onderzoeken of de effectiviteit van baculovirussen kon worden verhoogd door ze zodanig genetisch te modificeren dat ze tijdens hun infectie snel-werkende, insekt-specifieke toxines produceren.</p><p>Bij de aanvang van het onderzoek leken de insekt-specifieke kristaleiwitten, die geproduceerd worden door de bodembacterie <em>Bacillus</em><em>thuringiensis</em> tijdens sporulatie, veelbelovend omdat ze zeer toxisch zijn voor insektelarven, snel werken en biologisch afbreekbaar zijn. Daarnaast overlapt de gastheerreeks gevoelig voor deze toxische kristaleiwitten grotendeels met die van baculovirussen en is hun werkingsmechanisme reeds uitgebreid onderzocht. Bovendien hebben deze toxines geen effect op andere levensvormen, zoals de mens, hogere dieren en planten.</p><p>Allereerst werd onderzocht of het prototype van de baculovirussen, het kernpolyedervirus van de spanrups <em>Autographa californica</em> ( <em>Ac</em> NPV), in staat zou zijn tijdens infectie deze <em>B.</em><em>thuringiensis</em> toxines in voldoende mate en in een biologisch actieve vorm te produceren (Hoofdstuk 2). In insektecelcultures bleek, dat tijdens een infectie met een recombinant- <em>Ac</em> NPV, waarin het cryIA(b) toxine-gen achter de late polyhedrine-promoter van het virus was geplaatst, grote hoeveelheden biologisch actief protoxine geproduceerd konden worden. Deze protoxines bleken in insektecellen uit te kristalliseren in de voor deze eiwitten karakteristieke bi-piramidale vorm. Daarnaast konden deze kristallen in een alkalisch milieu opgelost worden en waren de hieruit vrijgekomen protoxines (130 kDa) met een trypsine te activeren tot actief toxine (± 60 kDa). Deze toxines bleken vervolgens specifiek te binden aan microvilli van middendarmcellen van gevoelige insekten. Deze toetsen toonden aan dat het door <em>Ac</em> NPV geproduceerde protoxine op zichzelf biologisch actief is (Hoofdstukken 2 en 3), maar dat het virus na toevoeging van dit protoxine-gen geen grotere effectiviteit (snellere doding) ten opzichte van insektelarven tentoonspreid.</p><p>Kristaleiwitten van <em>B.</em><em>thuringiensis</em> zijn toxisch voor larven ongeacht of ze oraal danwel via injectie in de hemocoel worden toegediend aan het insekt. In de hemocoel is alleen het trypsine- geactiveerde toxine werkzaam, kennelijk omdat daar de activatie tot toxine niet kan plaatsvinden. Willen kristaleiwitten dus in staat zijn de effectiviteit van baculovirussen te verhogen dan zullen deze eiwitten tijdens de virusinfectie uitgescheiden dienen te worden in het lumen van de middendarm of in de hemocoel. Bij secretie in de hemocoel zal om bovengenoemde reden het actieve toxine tot expressie gebracht moeten worden. Beide opties zijn verder onderzocht.</p><p>Om het actieve toxine tot expressie te kunnen brengen werd bepaald welk deel van het protoxine overeenkomt met het actieve toxine. Het N-terminale aminozuur van het actieve toxine was reeds bekend (isoleucine 29 van het protoxine); de C-terminus echter nog niet precies. Met behulp van plaatsgerichte mutagenese werd bepaald dat een polypeptide dat de aminozuurresiduen 29 tot en met 607 van het protoxine bevat, zonder trypsine-activatie werkzaam is (Hoofdstuk 4). Verrassend genoeg bleek dit polypeptide ook toxisch te zijn voor <em>E. coli</em> cellen die, voor zover bekend, geen receptoren voor <em>B. thuringiensis</em> toxines bezitten. Zelfs wanneer het domein van het toxine dat bindt aan de receptor in middendarmcellen uit dit toxine werd gedeleteerd, bleek dit ingekorte eiwit toxisch voor <em>E. coli</em> te zijn, hetgeen suggereert dat in het geval van <em>E. coli</em> geen receptor nodig is om poriën in membranen te introduceren.</p><p>Om de diverse <em>B.</em><em>thuringiensis</em> -toxineconstructen in insektecellen en -larven te kunnen testen werden deze geïnserteerd in het <em>Ac</em> NPV-genoom onder controle van de promoter van het p10 gen. Dit gen is niet essentieel voor de infectie van larven, maar speelt een rol bij de verspreiding van het virus in het milieu. Daarnaast garandeert de p10 promoter (evenals de polyhedrine promoter) hoge expressie laat in infectie. Omdat het genoom van een baculovirus relatief groot is (130 kilobaseparen), is het alleen mogelijk een nieuw gen aan het virusgenoom toe te voegen via homologe recombinatie van een transfervector waarin het nieuwe gen geflankeerd wordt door virale sequenties en het virus DNA. Homologe recombinatie treedt van nature slechts met een lage frequentie op (± 0.5%). Om recombinante baculovirussen op efficiëntere wijze te kunnen produceren werd eerst een recombinant-baculovirus geconstrueerd, waarbij het p10 gen vervangen werd dooreen unieke knipplaats voor een restrictie-enzym. Hierdoor kon het virale DNA voorafgaand aan een cotransfectie gelineariseerd worden. Lineair viraal DNA is niet infectieus doordat er geen replicatie van het genoom kan plaatsvinden. Pas na recombinatie met een transfervector ontstaat weer een circulair viraal genoom dat wel repliceert. Door gebruikmaking van dit principe kon het percentage recombinante virussen na een co-transfectie verhoogd worden tot 20 à 30%, waardoor de isolatie van de recombinante virussen aanmerkelijk werd versneld (Hoofdstuk 5).</p><p>Om te bepalen of de toevoeging van <em>B. thuringiensis</em> -kristaleiwitten de effectiviteit van baculovirusinfectie bij insekten kan verhogen, is een aantal verschillende recombinante virussen gemaakt (Hoofdstuk 6). Eén van deze recombinanten bracht het volledige protoxine tot expressie, een tweede een verkort protoxine waardoor het eiwit niet meer uitkristalliseert en een derde het actieve toxine uit Hoofdstuk 4. Een drietal gelijksoortige recombinanten werd geproduceerd, waarvan de genoemde polypeptides waren voorzien van een signaalpeptide, om uitscheiding ervan uit cellen mogelijk te maken. Tijdens de virusinfectie bleek dat de protoxines in alle gevallen in grote hoeveelheden geproduceerd werden. Daarnaast bleek dat er nagenoeg geen kristaleiwitten aangetroffen werden in het medium van cellen die geïnfecteerd waren met recombinanten waarvan de protoxines voorzien waren van een signaalpeptide. Dit betekent dat er geen noemenswaardige uitscheiding had plaatsgevonden. Het feit dat dit kristaleiwit moeilijk te secreteren is, wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, want het gebruikte signaalpeptide bleek voor andere eiwitten uitstekend te functioneren.</p><p>Recombinanten, die een actief toxine tot expressie brengen, waren moeilijk te verkrijgen. Het actieve toxine is zeer waarschijnlijk cytotoxisch voor insektecellen. Deze recombinanten produceerden tijdens de infectie ook geen polyeders en waren daarnaast zeer instabiel. Polyeders zijn noodzakelijk voor een goede biologische analyse (biotoets) van recombinante virussen. De onmogelijkheid om polyeders te isoleren van deze recombinant leidde ertoe dat de laatstgenoemde recombinanten niet verder biologisch getoetst konden worden. Van de overige recombinanten werd uiteindelijk de biologische activiteit voor larven van de Floridamot <em>(Spodoptera exigua)</em> bepaald. Zowel de mediaan letale dosis (LD ₅₀ ) als de mediaan letale tijd (LT ₅₀ ) van deze geteste recombinanten bleek niet significant te verschillen van die van het <em>wild</em><em>type</em> virus. Derhalve kon geconcludeerd worden dat <em>B. thuringiensis</em> -protoxines, alhoewel op zichzelf biologisch actief, niet in staat zijn de dodingssnelheid van deze baculovirussen te verhogen. De reden hiervoor is dat de in insektecellen geproduceerde protoxines vermoedelijk biologisch inactief zijn tijdens de infectie, omdat er geen activatie intracellulair kan plaatsvinden. Bovendien bleek dat het niet mogelijk was om deze protoxines uit te scheiden naar een plaats waar deze activatie wel zou kunnen optreden, zoals bijvoorbeeld in de middendarm, zodat de recombinanten, waarvan het protoxine voorzien was van een signaalpeptide, qua biologische activiteit niet van het <em>wild type</em> virus verschilden.</p><p>Het in dit proefschrift beschreven onderzoek geeft aan dat insekt-specifieke toxines van <em>B. thuringiensis</em> op dit moment (nog) niet geschikt zijn om de effectiviteit van baculovirussen bij de bestrijding van insekten te verhogen. Verbetering van de secretie van het protoxine of regulering van de expressie van het actieve toxine door gebruik te maken van een induceerbare promoter zou mogelijk in de toekomst kunnen resulteren in bruikbare recombinante virussen op basis van het toxine van <em>B. thuringiensis.</em>