Generative transmission of the translocation chromosome in tertiary trisomics of rye : genetic and physiological aspects

In dit proefschrift is de generatieve transmissie (overdracht) van het extra translocatiechromosoom in tertiaire trisomen van rogge ( Secale cereale L. ) bestudeerd.Tertiaire trisomen hebben een extra translocatiechromosoom en bevatten dus, in het geval van diploide rogge, 15 chromosomen. Zij ontstaan in lage frequenties in de zelfbevruchtingsnakomelingschappen van translocatieheterozygoten en worden gebruikt in (cyto)genetisch onderzoek. Een mogelijke toepassing in de plantenveredeling is het gebruik van tertiaire trisomen als "gebalanceerd chromosoomsysteem" voor de hybrideveredeling met behulp van genetische mannelijke steriliteit.Bij het gebruik van deze steriliteit (die meestal recessief overerft) voor de productie van hybridezaad is de Instandhouding en vermeerdering van de mannelijk steriele ( msms ) moederlijn een probleem. Dit kan opgelost worden met behulp van "gebalanceerde tertiaire trisomen" (BTT's) volgens een methode die voor gerst ontworpen werd. Als op het, translocatiechromosoom van een tertiair trisoom het dominante allel Ms ligt, en op belde overeenkomstige normale chromosomen het recessieve ms dan is de trisoom mannelijk fertiel ( Msmsms ). Als het extra chromosoom niet via het pollen overgedragen wordt en men gebruikt deze trisoom om mannelijk steriele disomen te bestuiven, dan ontstaan in de nakomelingschap weer uitsluitend mannelijk steriele disome ( msms ) planten. Deze kunnen wederom bestoven worden, etc.De tertiaire trisomen zelf worden gehandhaafd en vermeerderd door zelfbevruchting. Aangezien een extra chromosoom normaliter wel via de eicel overgedragen kan worden, ontstaan in de nakomelingschap weer tertiaire trisomen ( Msmsms ) en disomen ( msms ). om deze tijdig van elkaar te scheiden, kan gebruik worden gemaakt van een recessief (conditioneel) letaal marker gen dat eveneens op het translocatiechromosoom ligt. Wanneer het extra chromosoom weer het dominante allel ( A ) bevat en de normale chromosomen het recessieve ( a ), dan zijn de na zelfbevruchting ontstane disomen (conditioneel) letaal ( aa ). Uiteindelijk zullen alleen de tertiaire trisomen overleven: zij zijn "gebalanceerd".Voor het succesvol toepassen van een dergelijk systeem moet aan diverse voorwaarden voldaan worden. De recombinatie tussen de genen Ms en A en het translocatiebreukpunt moet laag zijn. Het extra translocatlechromosoom. moet een dusdanige nadelige invloed op de aneuploide mannelijke gametofyt uitoefenen, dat transmissie via het pollen voorkomen wordt. Tegelijkertijd mag het effect op de vrouwelijke gametofyt niet te groot zijn, aangezien een hoge transmissie via de eicel vereist is voor een efficiënte vermeerdering van de BTT. Ook de fertiliteit van de trisome sporofyt mag niet te sterk aangetast worden, met name wat betreft productie en kwaliteit van het pollen.Deze transmissie-problematiek is in dit proefschrift nader bestudeerd waarbij naast de genoemde fysiologische ook de genetische aspecten de aandacht hadden. Indien genetische variatie aanwezig is, kan selectie resultaat geven.In de experimenten is gebruik gemaakt van de tertiaire trisomen 240 en 282 (en soms van 501). Hierin bestaat het translocatiechromosoom telkens uit de korte arm en een stukje van de lange arm van chromosoom 5R, terwijl het uitgewisselde stuk verschilt. Op de korte arm 5RS ligt het marker gen Ti dat, in homozygoot recessieve vorm, bladafwijkingen veroorzaakt. Deze planten zijn levensvatbaar onder non-competitieve condities.In diverse F 5 lijnen van 240 en 282 en enkele van 501 werd de uitsplitsing bestudeerd en de transmissie en de recombinatie berekend. De transmissie varieerde van 0% tot 42%. Dit werd tot nog toe geacht uitsluitend het gevolg te zijn van transmissie via de eicel, aangezien tetrasomen meestal zeer zeldzaam zijn. Het laatste was ook in deze experimenten het geval. Echter, m.b.v. toetskruisingen werd hier aangetoond dat de transmissie via het pollen meestal 7% á 8% bedraagt. Het vrijwel ontbreken van tetrasomen kan dan verklaard worden door een verminderde levensvatbaarheid, met name in inteeltlijnen (Hoofdstukken 2 en 5).Er was, voor tertiair trisoom 282, een significante positieve correlatie tussen zaadkieming en transmissie in de inteeltlijnen. Ook waren bij hogere transmissie de trisomen groeikrachtiger. Dit impliceert dat er een relatie is tussen inteeltdepressie en transmissie: in inteeltlijnen met een sterke inteeltdepressie ondervinden trisome embryo's en zaailingen een extra selectief nadeel en gaan vaker verloren dan die in meer vitale lijnen (Hoofdstuk 5).Electroforese van bladextracten, gevolgd door eiwitkleuring, gaf kleine verschillen tussen en binnen lijnen te zien. Er werden geen systematische verschillen gevonden tussen trisomen en disomen of tussen tertiair trisoom 240 en 282. De activiteit van een glucose-6-fosfaat-dehydrogenase isoenzym, waarvan het structurele gen op 5RS gelocaliseerd was, was iets lager In trisomen dan in disomen. Soortgelijke effecten t.a.v. andere essentiële enzymen kunnen, gecumuleerd, de oorzaak zijn van het "aneuploidie syndroom" (morfologische en fysiologische afwijkingen) (Hoofdstuk 4).De mannelijke transmissie werd voor een groot aantal trisomen bepaald m.b.v. toetskruisingen met disomen. Trisomen van één F 5 lijn van tertiair trisoom 240 gaven een hogere transmissie (± 19%) dan andere. Dit verschil was ook aanwezig in de F 6 generatie en klaarblijkelijk genetisch bepaald (Hoofdstuk 2). In een F 5 lijn van 282 was de transmissie eveneens hoog, terwijl in een andere lijn een uitsplitsing in hogere en lagere transmissie leek op te treden. Deze verschillen waren minder duidelijk in de F 6 (Hoofdstuk 5).De aanwezigheid van genetische variatie biedt mogelijkheden voor selectie. Echter, genotypen met lage mannelijke transmissie waren vrij zeldzaam en het uitvoeren van toetskruisingen is zeer bewerkelijk. Daarom is getracht na te gaan, waar in de ontwikkeling en het functioneren van de aneuploide mannelijke gametofyten deze een selectief nadeel ondervinden. Het lijkt logisch te veronderstellen dat in hetzelfde proces de genetische verschillen zich zullen manifesteren.Uit analyse van de meiose bleek dat, dankzij goede paring en chiasmavorming en het overwegend zig-zag oriënteren van multivalenten, minstens 40% aneuploide microsporen verwacht mogen worden (Hoofdstukken 1 en 2).Tellingen in de eerste pollenmitose gaven zelfs een hoger percentage (46%) aan. Tevens bleek dat deze deling in aneuploide microsporen later optreedt dan in euploide, m.a.w. de aneuploide ontwikkelen zich trager. Hoewel er verschillen waren in de mate van deze vertraging, was deze niet gecorreleerd met de hoogte van de mannelijke transmissie. De vertraging is dus niet de factor die deze transmissie bepaalt en het lijkt zelfs waarschijnlijk dat de aneuploide microsporen zich normaal, zij het vertraagd, tot rijpe pollenkorrels kunnen ontwikkelen (Hoofdstukken 1 en 2).Wanneer toetskruisingen met een zéér klein aantal (gemiddeld vier) pollenkorrels uitgevoerd werden, bleek de mannelijke transmissie een stuk hoger te zijn dan bij normale (overvloedige) bestuivingen. Dit betekent dat certatie tussen euploide en aneuploide pollenkorrels optreedt en dat dit een zeer belangrijke factor In de hoogte van de mannelijke transmissie is. Ook werd duidelijk dat tenminste 20% (voor 240) resp. 27% (voor 282) van de rijpe pollenkorrels aneuploid is geweest en waarschijnlijk zelfs meer (Hoofdstukken 3 en 5).Er is getracht na te gaan hoe hoog dit percentage was door het uitvoeren van DNA-metingen aan de pollenkernen met behulp van fluorochromen en flowcytometrie. De fluorescentie van de dikke exinewand van het pollen verstoorde de metingen. Er werden succesvolle pogingen ondernomen de exine te verwijderen. Hoewel in de ontstane "intinoplasten" nu uitsluitend de kernen fluoresceerden, bleek de variantie in de metingen nog steeds te groot te zijn om de euploide en aneuploide pollenkorrels te onderscheiden (Hoofdstuk 6).De kwaliteit van het door tertiaire trisomen geproduceerd pollen bleek vrij hoog te zijn, zelfs in inteeltlijnen. Heterotische trisomen gaven soms een nog iets hogere kwaliteit. Er was geen duidelijke correlatie tussen de hoogte van de mannelijke transmissie en de pollenkwaliteit (i.e. de potentiële kieming). (Hoofdstuk 5).Biochemisch was geen verschil aantoonbaar tussen pollen van trisomen en dat van disomen. Het gen voor het isoenzym van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase, dat in de trisome sporofyt een verlaagde activiteit te zien gaf, kwam in de gametofyt niet tot expressie (Hoofdstuk 4).Tenslotte werden de kieming en buisgroei van pollen van trisomen en dat van disomen bestudeerd na bestuivingen onder kascondities. De resultaten waren zeer variabel, vaak was de kieming laag en de buisgroei gering. Het pollen van Gramineeën is i.h.a. zeer gevoelig voor condities die de rehydratatie van pollenkorrels op de stempel beïnvloeden. Echter, in één experiment met hoge kieming gaf de frequentiever deling van de pollenbuisgroel van een trisoom twee toppen te zien, wat in een vergelijkbare disoom niet duidelijk het geval was. Ook was in de trisoom de gemiddelde buisgroei lager en de variantie relatief groter. Deze trisoom vertoonde een gematigde mannelijke transmissie.In een trisoom met hoge mannelijke transmissie week de gemiddelde buisgroei niet af van die van een vergelijkbare disoom. Ook waren hier geen duidelijke pieken te onderscheiden (Hoofdstuk 6). Hoewel deze resultaten niet erg volledig waren, lijken ze de conclusie te bevestigen dat de mannelijke transmissie voornamelijk bepaald wordt door de relatieve buisgroei van euploide en aneuploide pollenkorrels. Het lijkt waarschijnlijk dat in genotypen met lagere transmissie de buisgroei van de aneuploide gametofyten sterker geremd is dan in andere genotypen. Vooralsnog lijkt het moeilijk op grond hiervan deze genotypen te selecteren. Het is aan te bevelen eerst de condities die de pollenbuisgroel beïnvloeden nader te bestuderen en gestandaardiseerde en accurate methoden te ontwikkelen om deze te meten.Met betrekking tot de toepassing van gebalanceerde tertiaire trisomen In de hybrideveredeling, zoals In het begin van dit hoofdstuk beschreven, kan een aantal conclusies getrokken worden.Voor een efficiënte vermeerdering van BTT's is een hoge vrouwelijke transmissie bij zelfbevruchting noodzakelijk. Gebleken is dat selectie tegen een sterke inteeltdepressie en tegen gevoeligheid voor aneuploidie de beste basis Is om deze te bereiken. Het dient vermeden te worden uitsluitend op hoge transmissie bij zelfbevruchting te selecteren. Een deel van de trisomen is Immers via mannelijke transmissie ontstaan en de kans is groot dat men tevens genotypen met een hoge mannelijke transmissie selecteert.In tegenstelling tot wat in het verleden aangenomen werd, kan de mannelijke transmissie van het translocatiechromosoom wel een belangrijk struikelblok vormen voor toepassing van het BTT-systeem. De transmissie is i.h.a. zo hoog dat ook niet verwacht mag worden dat de trisome nakomelingen In een overigens disome nakomelingschap weggeconcurreerd kunnen worden. De mannelijk fertiele trisomen, die dan in de mannelijk steriele moederlijn voorkomen, kunnen een aanzienlijk deel van deze lijn bevruchten en zo de groeikracht en de uniformiteit van de "hybriden"-populatie reduceren.Duidelijke verschillen tussen de tertiaire trisomen 240 en 282 (en 501) zijn in geen enkel experiment gevonden. Waarschijnlijk is het vooral de grootte van het translocatiechromosoom die de effecten op de gametofyten en de sporofyt bepaalt. Het kan echter niet worden uitgesloten dat er bepaalde chromosoomsegmenten bestaan, die wel een specifieke invloed op de mannelijke of vrouwelijke transmissie uitoefenen.Tenslotte is het opmerkelijk dat de recombinatiefrequentie tussen ti en het translocatiebreukpunt in de tertiaire trisomen vrij hoog was. In de translocatieheterozygoten, waaruit de tertiaire trisomen ontstaan zijn, was deze zeer laag. Het lijkt dus weinig zinvol om de voor het BTT-systeem benodigde selectieve markers te selecteren op grond van de recombinatie in de heterozygoot. Het aantal recessieve semi-Ietale markers, dat voor rogge beschikbaar Is, is echter vrij groot.