The relationship between biotransformation and toxicity of halogenated benzenes : nature of the reactive metabolites and implications for toxicity

Lipofiele xenobiotica worden in het lichaam door middel van biotransformatie omgezet in polaire metabolieten, zodat excretie via urine enlof faeces mogelijk wordt. In de meeste gevallen resulteert biotransformatie in de ontgifting van toxische stoffen. Er zijn echter vele stoffen bekend die op zichzelf weinig schadelijk zijn, maar juist als gevolg van biotransformatie worden omgezet in reactieve produkten (zgn. 'metabole activatie'), die vervolgens de normale fysiologie van een cel, weefsel of organisme kunnen verstoren. Voor een beter inzicht in de relatie tussen chemische structuur van een stof en zijn effect(en) op levende organismen is kennis van de verschillende routes, waarlangs een stof wordt omgezet, onontbeerlijk.In hoofstuk 1 wordt een beknopte beschrijving gegeven van de belangrijkste biotransformatie systemen, die betrokken zijn bij de omzetting van xenobiotica, en van de bijdrage die deze systemen kunnen leveren aan de metabole activering enlof toxiciteit van xenobiotica. Gehalogeneerde benzenen vormen een goed voorbeeld van een groep van stoffen, waarbij metabole activatie een rol speelt in de toxische effecten op de verschillende doelorganen (met name lever en nier). Figuur 1.2 (zie pagina 33) maakt duidelijk dat uit een betrekkelijk eenvoudige stof, zoals een halogeenbenzeen, verschillende reactieve intermediairen en metabolieten gevormd kunnen worden. Het vele onderzoek naar het mechanisme van levertoxiciteit door broombenzeen wijst op een belangrijke rol voor het intermediair 3,4-epoxide. Echter, tijdens de oxidatie van het volledig gesubstitueerde hexachloorbenzeen zijn het niet de epoxides, maar juist reactieve chinon metabolieten (met name tetrachloorbenzochinon), die covalent aan eiwit binden. Daarnaast zijn er sterke aanwijzigingen dat de niertoxiciteit door broombenzeen is toe te schrijven aan de vorming van chinon metabolieten, die na conjugatie met glutathion naar de nier getransporteerd worden en daar proximale tubulaire schade veroorzaken.Het onderzoek dat staat beschreven in dit proefschrift is uitgevoerd om meer inzicht te verkrijgen in het belang van de verschillende intermediairen en metabolieten in de toxiciteit van een hele serie gehalogeneerde benzenen. Experimenten zijn met name uitgevoerd met (poly-)chloorbenzenen. Enerzijds zijn er in vitro studies gedaan met [ 14C]-gelabelde substraten en microsomale suspensies om de verschillende biotransformatie routes te karakterizeren en het belang van deze routes in de metabole activatie te evalueren (Deel I, hoofdstuk 2, 3, 4, en 5; samengevat in hoofdstuk 6). Anderzijds zijn in vivo studies uitgevoerd om (i) een inschatting te krijgen van de toxiciteit van een reeks chloorbenzenen op de verschillende doel organen, en (ii) meer inzicht te krijgen in de rol van de verschillende metabolieten in de toxische effecten (Deel II, hoofdstuk 7, 8, en 9; samengevat in hoofdstuk 10).Deel I In vitro studiesIn het eerste deel van dit proefschrift komt de vraag aan de orde óf, en zo ja in welke mate, een serie polychloorbenzenen geoxideerd kan worden tot reactieve produkten die covalent aan eiwit kunnen binden. Hiertoe werden microsomale incubaties met [ 14C]-gelabelde substraten uitgevoerd.In hoofdstuk 2 wordt de microsomale oxidatie van pentachloorbenzeen (PCB) naar pentachloorfenol beschreven. Daarnaast worden de verschillende isomeren van tetrachloorfenol gevormd alsmede tetrachloorhydrochinon. Tijdens de oxidatie van PCB worden metabolieten gevormd, die covalent binden aan eiwit. Incubaties uitgevoerd in de aanwezigheid van ascorbine zuur, een reductor, tonen het belang van chinon metabolieten in de eiwit binding aan. Vanwege het feit dat de eiwitbinding ondanks een grote overmaat ascorbine zuur nooit geheel voorkomen kan worden, wordt de suggestie gedaan dat andere metabolieten, waarschijnlijk de epoxides in de primaire oxidatie van PCB naar pentachloorfenol, ook een bijdrage leveren aan de eiwitbinding.Hoofdstuk 3 beschrijft de microsomale oxidatie van 1,2,4-trichloorbenzeen (1,2,4-TRICB). 1,2,4-TRICB wordt geoxideerd tot de verschillende isomeren van trichloorfenol en, in mindere mate, tot trichloorhydrochinon. De vorming van de 2,3,4- en 2,4,6-trichloorfenol kan verlopen via een zgn. 'NIH-shift' van de overeenkomstige epoxide intermediairen in de primaire oxidatie stap. In overeenkomst met het microsomaal metabolisme van PCB blijkt een belangrijk deel van de metabolieten covalent aan eiwit te binden. Opvallend is echter dat de eiwitbinding van 1,2,4-TRICB metabolieten volledig voorkomen wordt door de aanwezigheid van ascorbine zuur in de microsomale incubatie. Daarnaast blijkt dat zowel voor 1,2,4-TRICB als voor PCB de mate van eiwit binding sterk gecorreleerd is met de mate van secundaire oxidatie van de fenol metabolieten, en niet met de mate van primaire oxidatie van de benzenen. Op grond van deze waarnemingen wordt geconcludeerd dat chinon metabolieten de enige reactive species zijn in de oxidatie van zowel 1,2,4-TRICB als PCB. In plaats van de aanname dat de 'rest' binding van PCB metabolieten aan eiwit in de aanwezigheid van ascorbine zuur (zie hoofdstuk 2) veroorzaakt wordt door een ander type reactieve metaboliet, kan als verklaring dienen een onvolledige reductie van het reactieve tetrachloorbenzochinon tot tetrachloorhydrochinon.Hoofdstuk 3 beschrijft ook de invloed van de cytochroom P450 samenstelling van de microsomale suspensies op de oxidatie van PCB en 1,2,4-TRICB. Microsomen van ratten voorbehandeld met dexamethason (DEX), een stof die de hoeveelheid P450IIIA1 sterk induceert, zetten de beide substraten het beste om, in analogie met wat gevonden was voor hexachloorbenzeen (HCB) (Van Ommen et al. , 1989). Het blijkt echter dat met afnemende substitutie graad de bijdrage van P450IIIA1 aan de oxidatie minder prominent wordt, en de relatieve bijdrage van andere isoenzymen belangrijker. De microsomale studies met twee isomeren van dichloorbenzeen bevestigen deze tendens (zie hoofdstuk 4).Van twee dichloorbenzeen isomeren (DCB; i.e. 1,2- en 1,4-DCB) is een groot verschil in hepatotoxiciteit beschreven (zie ook hoofdstuk 7). In hoofdstuk 4 wordt de microsomale oxidatie van de toxische 1,2-isomeer en de niet-toxische 1,4-isomeer beschreven, met speciale aandacht voor mogelijke verschillen in metabolieten profiel die een rol kunnen spelen in de isomeer-selectieve hepatotoxiciteit. Zowel 1,2- als 1,4-DCB worden geoxideerd tot metabolieten die covalent aan eiwit binden. Een interessante waarneming is echter dat de eiwitbinding van 1,4-DCB metabolieten door de reductor ascorbine zuur volledig geremd kan worden, terwijl dit voor 1,2-DCB slechts gedeeltelijk mogelijk is. 'Molecular Orbital' computer berekeningen aan de arene oxide/ oxepin intermediairen van beide substraten tonen echter geen verschillen aan in chemische reactiviteit enlof stabiliteit van de verschillende arene oxide intermediairen van 1,2-DCB versus 1,4-DCB. Dit pleit tegen een rol van arene oxide intermediairen in de ('rest') eiwit binding van 1,2-DCB.Vooruitlopend op hoofdstuk 5, waarin het mechanisme van de vorming van reactieve chinon metabolieten wordt bestudeerd, wordt het optreden van restbinding van 1,2-DCB metabolieten aan eiwit in aanwezigheid van een reductor verklaard uit een directe oxidatie van de para -gesubstitueerde fenol metaboliet (i.e., 3,4,-dichloorfenol) naar het reactieve benzochinon. Een dergelijke directe oxidatie van de primaire fenol metaboliet van 1,4-DCB (i.e. 2,5-dichloorfenol; bezit geen halogeen substituent para ten opzichte van de hydroxyl groep) is niet mogelijk.Bovenstaande studies benadrukken het belang van de vorming van secundaire chinon metabolieten in de metabole activatie van gechloreerde benzenen. Het is daarom van belang om het mechanisme van vorming van deze reactieve produkten te bestuderen. Hiertoe worden pentafluor- en pentachloorfenol, en hun niet para gesubstitueerde analogen gebruikt als model stoffen. De oxidatie produkten in een microsomale incubatie worden geïdentificeerd met 19F-NMR en HPLC. Het karakter van de oxidatie produkten van de fenol substraten kan echter niet bestudeerd worden onder standaard condities met moleculaire zuurstof en NADPH als electronen donor voor cytochroom P450, vanwege het feit dat het aanwezige NADPH eventueel gevormd benzochinon (chemisch) kan reduceren tot hydrochinon. Daarom zijn anaerobe incubaties uitgevoerd, waarbij cumeen hydroperoxide werd gebruikt als zuurstof donor. Gebaseerd op de resultaten die beschreven staan in hoofdstuk 5, wordt een mechanisme voorgesteld voor de P450 afhankelijke oxidatie van halogeenfenolen, waarbij het al dan niet aanwezig zijn van een halogeensubstituent op de positie para ten opzichte van de hydroxyl groep een bepalende factor is voor het karakter van het produkt (i.e. hydrochinon vs benzochinon). Cytochroom P450 afhankelijke oxidatie op een niet-gesubstitueerde para positie resulteert in de vorming van het para -hydroxyl derivaat (i.e. hydrochinon) als primair produkt. Daarentegen resulteert cytochroom P450 afhankelijke oxidatie op een para positie waar een halogeen substituent zit in de directe vorming van een reactief benzochinon onder verlies van het halogeen als een halogeen anion. In Hoofdstuk 11 wordt ingegaan op mogelijke toxicologische implicaties van directe vorming van reactieve benzochinon metabolieten.Deel II In vivo studiesIn deel II van dit proefschrift staan de resultaten van twee in vivo studies beschreven, waarbij de toxiciteit van een hele serie chloorbenzenen op de verschillende doel organen is vastgesteld. Tevens wordt getracht de diverse effecten te correleren met de vorming van verschillende metabolieten.In Hoofdstuk 7 wordt een hele serie chloorbenzenen vergeleken met betrekking tot hun potentie om toxiciteit te veroorzaken in verschillende doel organen na een éénmalige i.p. toediening in de rat. Effecten op de lever bestaan uit een toegenomen relatief levergewicht op 72 uur na toediening, hetgeen voor de hoger gechloreerde benzenen ook nog waarneembaar is na 216 uur. In de meeste behandelingsgroepen wordt een variabele mate van centrilobulaire hypertrofie en hepatocellulaire degeneratie waargenomen. Van alle congeneren die getest zijn, geven 1,2-dichloorbenzeen en 1,2,4- trichloorbenzeen de meest ernstige effecten, hetgeen blijkt uit een sterke stijging van de plasma ALT spiegels, en duidelijk waarneembare histopathologische degeneratieve veranderingen. Monochloorbenzeen was minder toxisch. In deze studie worden geen schadelijke effecten op de lever waargenomen na blootstelling aan 1,4-dichloorbenzeen en 1,2,4,5-tetrachloorbenzeen, terwijl blootstelling aan pentachloorbenzeen resulteert in slechts geringe histopathologische veranderingen in de lever. Hieruit kan dus geconcludeerd worden dat de mate van metabole activatie zoals waargenomen in vitro (deel I) geen goede weergave biedt van de potentie om leverschade te veroorzaken.Er worden in de gebruikte dosis range geen degeneratieve effecten waargenomen op de nieren. Wel blijkt de vorming van 'Protein Droplets' in de tubulaire epitheel cellen een algemeen verschijnsel te zijn na (éénmalige) blootstelling aan gechloreerde benzenen. Dit effect was sterker en gedurende langere tijd waarneembaar na blootstelling aan de hoger gechloreerde congeneren.Een interessante waarneming betreft het feit dat chloorbenzenen de schildklierhormoon huishouding verstoren, hetgeen tot uiting komt in een sterke daling van de plasma thyroxine spiegels. Hoger gechloreerde benzenen veroorzaken een sterker daling, en deze daling blijkt tevens op te treden na subchronische toediening van een lage dosis (hoofdstuk 8). Verstoring van de schildklierhormoon huishouding is ook beschreven voor de polychloorbiphenylen (Brouwer, 1989), verbindingen die wat betreft chemische structuur grote overeenkomsten vertonen met chloorbenzenen. Er worden in hoofdstuk 7 aanwijzingen geleverd voor een gemeenschappelijk werkingsmechanisme, waarbij de vorming van fenol metabolieten een cruciale factor is: door een selectieve interactie van fenol metabolieten met transthyretiene, een belangrijk plasma transport eiwit voor schildklierhormoon in de rat, wordt het plasma transport van thyroxine ernstig verstoord, hetgeen resulteert in verlaging van de plasma spiegels.In hoofdstuk 8 en 9 worden de resultaten beschreven van een 13-weken dieet studie in de rat (♀) met hexachloorbenzeen (HCB) en pentachloorbenzeen (PCB). Vergelijking van de toxiciteit en van de biotransformatie van deze twee congeneren is interessant, aangezien in vitro studies hadden aangetoond dat zowel HCB als PCB geoxideerd worden tot pentachloorfenol (PCP) en het reactieve tetrachloorbenzochinon (TCBQ) (zie Van Ommen et al., 1986; hoofdstuk 2). Daarnaast zijn er sterke aanwijzing dat hetzelfde cytochroom P450 isoenzym (P450IIIA) betrokken is bij de omzetting van deze stoffen (Van Ommen et al., 1989; hoofdstuk 3).De subchronische studie beschreven in hoofdstuk 8 was met name gericht om meer inzicht te krijgen in de rol van de oxidatieve metabolieten in de diverse toxische effecten van HCB en PCB. Bijzondere aandacht was er voor de mogelijke rol van het reactieve TCBQ in het ontstaan van porfyrie. Hiertoe werd de excretie van PCP en tetrachloorhydrochinon, de gereduceerde vorm van TCBQ, in de urine gevolgd in de tijd. Daarnaast werd het effect bestudeerd van selectieve beinvloeding van de cytochroom P450IIIA activiteit op de toxiciteit (met name porfyrie) en de biotransformatie van HCB en PCB, door gelijktijdige behandeling met het macrolide triacetyloleandomycine (TAO).Blootstelling van ratten (♀) aan HCB (300 ppm) via het voer resulteert in een sterke toename van de porfyrine excretie via de urine en in een sterke accumulatie van porfyrines in de lever. Deze effecten van HCB worden sterk geremd door gelijktijdige blootstelling aan TAO. Gecombineerde blootstelling van ratten aan HCB of PCB met TAO resulteert tevens in een duidelijk verlaagde uitscheiding van de oxidatieve metabolieten, PCP en TCHQ. De vermindering van de porfyrinogene effecten van HCB kunnen echter niet verklaard worden uit een verminderde vorming van het reactieve TCBQ, aangezien ratten die worden behandeld met een hoge dosis PCB (1300 ppm) een urinaire excretie van TCHQ hebben die enkele malen hoger is dan in ratten die het HCB dieet krijgen, terwijl deze ratten géén porfyrie ontwikkelen. De goede correlatie die werd waargenomen tussen porfyrie en PCP excretie kunnen echter wel de hypothese ondersteunen, waarin een reactief intermediair in de primaire oxidatie stap van HCB naar PCP wordt voorgesteld als uiteindelijke porfyrinogene species. In dit opzicht is met name een nieuw gepostuleerd type (reactief) intermediar met een chinon-structuur (Rietjens en Vervoort, 1992) interessant voor verder onderzoek.In hoofdstuk 9 wordt de biotransformatie van HCB en PCB beschreven, waarin de metabolieten profielen in de urine worden vergeleken. Zoals reeds besproken in hoofdstuk 8, worden HCB en PCB in vivo geoxideerd tot PCP en TCHQ. Dit blijken echter de enige twee gemeenschappelijke metabolieten van HCB en PCB, die worden uitgescheiden via de urine. Overige metabolieten van HCB zijn het pentachloorfenylmercaptuurzuur, kwantitatief de belangrijkste metaboliet, en mercaptotetrachloorthioanisool. PCB wordt omgezet in een groter aantal zwavelbevattende verbindingen, waarbij mercaptotetrachloorfenol en pentachloorthiofenol de belangrijkste produkten zijn.PCB wordt, behalve tot PCP, in belangrijke mate ook geoxideerd tot 2,3,4,5-tetrachloorfenol (TCP). Opvallend is dat de excretie van 2,3,4,5-TCP niet geremd wordt door gecombineerde blootstelling van ratten aan PCB en TAO, de remmer van P450IIIA. Dit wijst erop dat (i) de oxidatie van PCB tot PCP en tot 2,3,4,5-TCP verloopt via verschillende routes, en dat (ii) cytochroom P450IIIA niet betrokken is bij de oxidatie van PCB tot 2,3,4,5-TCP. Gecombineerde blootstelling van PCB en TAO had geen éénduidig effect op de excretie van zwavelbevattende metabolieten. Zo blijkt bijvoorbeeld dat de excretie van mercaptotetrachloorfenol niet geremd wordt door TAO, terwijl die van (het glucuronide van) pentachloorthiofenol sterk geremd wordt. De resultaten van deze studie onderstrepen het belang van meer gedetailleerde studies naar de interactie tussen fase I metabolisme (oxidatieve systemen, met name cytochroom P450) en fase II metabolisme (conjugatieve systemen, met name glutation conjugatie) om uiteindelijk een beter begrip te krijgen van de routes waarlangs de verschillende metabolieten gevormd worden.