Etude structurale et fonctionnelle de la protéine à radical SAM Hyde

Radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) proteins use a reduced [Fe4S4] cluster to initiate homolytic reductive cleavage of SAM, which leads to the formation of highly reactive 5'-deoxyadenosyl radical species or 5'-dA•. In almost all cases this alkyl radical will abstract a hydrogen atom from the substrate and thus trigger its conversion into product. These enzymes are found in key steps of the synthesis of certain vitamins, antibiotics, DNA precursors or protein cofactors. They are often involved in the cleavage or formation of C-C, C-N, C-S or C-P bonds. The present thesis work has been focused on the structural and functional study of HydE protein; a radical SAM enzyme, involved in the biosynthesis of the organometallic active site of [FeFe]-hydrogenase. The main goal was to identify the substrate of HydE and to study details of how radical SAM proteins control the highly oxidizing 5'-dA• species. We managed to identify a group of molecules, derived from cysteine, containing a thiazolidine ring with one or two carboxylate groups, which have a very good affinity for the active site of HydE. We have demonstrated some of these ligands are non-physiological substrates of the enzyme. With these substrates we could highlight a new radical attack mechanism in radical SAM proteins. Indeed, in HydE we observed a direct attack on the 5'-dA • radical on the sulfur atom of the thioether belonging to the thiazolidine ring. This is an unprecedented reaction that contrasts with sulfur (or selenium) atom insertion reactions catalysed by some radical SAM enzymes. This is also the first observation of a radical reaction in the protein crystal of a radical SAM enzyme and also the first real-time monitoring by 1H- & 13C-NMR spectroscopy of the accumulation of products of the reaction catalysed by these enzymes. Theoretical calculations based on our high-resolution crystal structures suggest that in the case of this protein superfamily the 5'-dA• radical, which triggers the reaction in radical SAM enzymes, is a transition state and therefore not an isolable intermediate species.Les protéines à radical S-adénosyl-L-méthionine (SAM) utilisent un centre [Fe4S4] réduit pour initier le clivage réductive homolytique de la SAM et la formation d'une espèce hautement réactive - le radical 5'-déoxyadénosyl ou 5'-dA•. Dans la quasi-totalité de cas ce radical alkyl va arracher un atome d'hydrogène sur le substrat et déclencher ainsi sa conversion en produit. On trouve ces enzymes au niveau d'étapes clé de la synthèse de certaines vitamines, antibiotiques, précurseurs de l'ADN ou encore cofacteurs protéiques où elles sont souvent impliquées dans le clivage ou la formation des liaisons C-C, C-N, C-S ou encore C-P. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont été focalisés sur l'étude structurale et fonctionnelle de la protéine HydE ; une enzyme à radical SAM, qui intervient dans la biosynthèse du site actif organométallique de l'hydrogénase à [FeFe]. L'objectif principal était d'identifier le substrat de HydE et d'étudier les détails du fonctionnement d'une protéine à radical SAM. Nous avons réussi à identifier un groupe de molécules, dérivées de la cystéine, contentant un cycle thiazolidine avec un ou deux groupements carboxylates, qui ont une très bonne affinité pour le site actif de HydE. Certains de ces ligands se sont montrés d’être des substrats non physiologiques de l’enzyme. Grâce à ces substrats nous avons pu mettre en évidence un nouveau mécanisme d’attaque radicalaire dans les protéines à radical SAM. En effet, dans HydE nous avons observé une attaque directe du radical 5'-dA• sur l’atome soufre du thioéther appartenant au cycle thiazolidine. Cette réaction constitue un exemple pas comme les autres d’une insertion d’un atome de soufre (ou de sélénium) catalysée par une enzyme à radical SAM. Il s'agit également d'une première observation d'une réaction radicalaire dans les cristaux protéiques d'une enzyme à radical SAM et également un premier suivi en temps réel par la RMN du 13C et 1H de l'accumulation d'un des produits de la réaction catalysée par ces enzymes. Les résultats de calculs théoriques basés sur nos structures cristallographiques de haute résolution suggèrent que dans le cas de cette superfamille de protéines le radical 5'-dA• serait plutôt un état de transition et donc pas une espèce intermédiaire isolable