Evolución a largo plazo de virus RNA en ambiente biológico constante

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-05-2017Los virus RNA replican como distribuciones complejas y dinámicas que son denominadas cuasiespecies víricas. La dinámica de cuasiespecies es consecuencia de las altas tasas de mutación y de las interacciones intrapoblacionales que se establecen entre los componentes de un espectro de mutantes. La dinámica de cuasiespecies puede favorecer los incrementos de eficacia biológica o fitness y es un factor en la emergencia de genomas virales. Sin embargo, hay muchas cuestiones pendientes para el entendimiento general de las cuasiespecies. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral es examinar algunas de estas cuestiones utilizando dos virus RNA que replican durante largo tiempo en un ambiente constante proporcionado por células en cultivo. Durante los pases sucesivos en tiempo prolongado del virus de la fiebre aftosa (FMDV) en células de riñón de hámster (BHK-21) el virus acumuló múltiples mutaciones puntuales y dio lugar a la segmentación de su genoma. Estos genomas fueron infecciosos por complementación y causaban muerte celular. En la presente Tesis Doctoral mostramos que las mutaciones puntuales localizadas en la región codificante de las proteínas no estructurales (P2, P3) incrementaron el fitness relativo de la versión segmentada. Por tanto, la acumulación de mutaciones puntuales fue esencial para permitir la dominancia del genoma segmentado. La complementación involucró a varias proteínas, una de ellas la proteína L. Nuestro estudio reveló que existían eventos a distancia durante el procesamiento de la poliproteína. Durante los pases sucesivos en tiempo prolongado del virus de la hepatitis C (HCV) en células de hepatoma humano, el virus se adaptó a las células, lo cual se probó por el aumento en la producción de progenie. La tasa de acumulación de mutaciones en la secuencia consenso y el análisis del espectro de mutantes revelaron una compleja dinámica de olas mutacionales que se incrementaba a partir del pase 100. Además, el virus mostró varios cambios fenotípicos: aumento de la muerte celular, resistencia parcial a inhibidores, cambio hacia una mayor densidad de la partícula y mayor inhibición de la síntesis de proteínas celulares. Fluctuaciones en la producción de progenie y la falta de equilibrio poblacional a nivel genómico sugieren inestabilidades internas. Mecanismos posibles para el desequilibrio poblacional serán analizados a la luz de la teoría de cuasiespecies.RNA viruses replicate as complex and dynamic mutant distributions that are termed viral quasispecies. Quasispecies dynamics is a consequence of high mutation rates and of the intrapopulation interactions that are established among components of a mutant spectrum. Quasispecies dynamic can favor viral fitness increases and eventually is a factor in the emergence of viral genomes. However, there are several pendent questions on the general understanding of viral quasispecies and disease features of viral pathogens. The main aim of this PhD thesis is to examine some of these issues using long-term replication of two RNA viruses in a non-coevolving environment provided by cells in culture. During long-term passages of Foot-and-mouth disease virus in baby hamster kidney-21 cells, the virus accumulated multiple point mutations and underwent a transition to genome segmentation. The standard single RNA genome molecule was replaced by genomes harboring internal in-frame deletions. These genomes were infectious and killed cells by complementation. In this PhD thesis, we show that the point mutations in the nonstructural protein-coding region (P2, P3) increased the relative fitness of the segmented version relative to the standard genome. Thus, the accumulation of point mutations was essential to permit dominance of the segmented genome. The complementation between the twogenome segments involved several viral proteins, one of them being the leader proteinase L. The study of complementation revealed distance effects on polyprotein processing events. During long-term passages of Hepatitis C virus in human hepatoma cells, the virus adapted to the cells, as evidenced by increase in progeny production. The rate of accumulation of mutations in the genomic consensus sequence and mutant spectrum analyses revealed a complex dynamics of mutational waves which was increased beyond passage 100. The virus underwent several phenotypic changes some of which affected the virus-host relationship, such as enhanced cell killing, partial resistance to several viral inhibitors, shift towards higher virion density, and increased shut-off of host cell protein synthesis. Fluctuations in progeny production and failure to reach population equilibrium at the genomic level suggest internal instabilities. Possible mechanisms for population disequilibrium are analyzed in the light of quasispecies theory