Genetic characterization of CIC: a tumor suppressor regulated by RAS signaling

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 13-02-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 13-08-2018CIC es un represor transcripcional regulado negativamente por la vía de MAPK (mitogen-activated protein kinases, proteínas quinasas activadas por mitógenos). En Drosophila, Cic tiene un importante papel en el establecimiento de los ejes del embrión. Además, su inactivación anula el requerimiento de la señalización mitogénica mediada por Ras. De forma notoria, recientemente se han identificado mutaciones en CIC en cáncer humano, principalmente en oligodendroglioma, lo que sugiere un posible papel como supresor tumoral. Con el fin de determinar el papel de CIC en la señalización homeostática por RAS así como en el desarrollo de tumores hemos generado una estirpe de ratón condicional de pérdida de función en la cual hemos rodeado con sitios LoxP el dominio de unión a ADN, una región requerida para la represión transcripcional, de las dos isoformas de CIC (Cic-L y Cic-S). La expresión en línea germinal de la proteína defectuosa CICΔ2-6 provoca letalidad perinatal, lo que indica que CIC posee una función clave en el desarrollo del ratón. Se extrajeron embriones a día embrionario 18.5 y en ese punto los ratones homocigotos estaban presentes en proporciones mendelianas. Sin embargo, la mayoría de ellos presentaba onfalocele, un defecto en la pared abdominal por el cual los intestinos y/o el hígado permanecen fuera del abdomen dentro del espacio umbilical. Con el objetivo de estudiar si la pérdida de función de CIC podía abolir el requerimiento de las proteínas RAS para la proliferación también en células de mamíferos, generamos una línea de ratón compuesta con el alelo condicional de Cic y la línea knockout condicional para las tres isoformas de RAS (Hras-/-, Nras-/-, Kraslox/lox). Abordamos esta pregunta tanto in vitro, utilizando MEFs (fibroblastos embrionarios murinos), como in vivo, con ratones adultos, pero la pérdida de función de CIC no pudo compensar la falta de RAS en ninguno de los sistemas mencionados. Asimismo, para estudiar el papel de CIC en ratones adultos, hemos cruzado la línea condicional de Cic con ratones que expresan una CreERT2 recombinasa inducible por tamoxifeno bajo un promotor ubicuo (el promotor de la Ubiquitina C humana) para determinar el papel de CIC en ratones adultos. La exposición de los ratones Ciclox/lox; Tg.UBC-CreERT2+/T a 4-Hidroxitamoxifeno en el destete resultó en el desarrollo de linfoma linfoblástico de las células T (T-ALL) durante el primer año de vida. Algunos de estos ratones presentaban también esplenomegalia causada por la infiltración de células tumorales. Estos tumores sobreexpresan los bien caracterizados genes diana de CIC, Etv4 y Etv5. Estos resultados generaron pruebas experimentales apoyando que CIC tiene un papel en la supresión tumoral. Además, la secuenciación de ARN de tumores T-ALL CicΔ2-6/Δ2-6 nos ha permitido generar una firma de expresión génica de pérdida de función de CIC, que proponemos se puede usar como indicativa de la inactivación de CIC. Hemos demostrado que tumores T-ALL producidos por un RAS oncogénico presentan un enriquecimiento en dicha firma, lo que sugiere que RAS podría inducir T-ALL mediante la inactivación de CIC.CIC is a transcriptional repressor negatively regulated by the MAPK (mitogen-activated protein kinases) pathway. In Drosophila, Cic plays an important role in embryo patterning. Moreover, its inactivation overcomes the need for Ras-mediated mitogenic signaling. Interestingly, mutations in CIC have recently been identified in human cancer, most notably in oligodendroglioma, suggesting a potential role as a tumor suppressor. To determine the role of CIC in homeostatic mammalian RAS signaling as well as in tumor development we generated a conditional loss-of-function allele in which we have targeted the DNA-binding domain, a region required for transcriptional repression, of the two CIC isoforms (Cic-L and Cic-S). Germline expression of the defective CICΔ2-6 proteins leads to perinatal lethality, thus indicating a key role for CIC in mouse development. Embryos were extracted at embryonic day 18.5 and, at this time point, homozygous mice were present at Mendelian rate. However, most of them presented omphalocele, an abdominal wall defect in which the intestines and/or liver remain outside of the abdomen inside the umbilical space. To study if CIC loss-of-function could bypass the requirement for RAS in proliferation also in mammalian cells, a compound strain carrying the Cic conditional allele with a conditional knockout strain for the three RAS isoforms (Hras-/-, Nras-/-, Kraslox/lox) was generated. We addressed the question both in vitro, using MEFs, and in vivo, with adult mice. Nevertheless, the absence of CIC function could not compensate for the lack of RAS in any of the mentioned systems. Furthermore, to assess the role of CIC in adult mice, we crossed the conditional Cic strain with mice expressing an inducible CreERT2 recombinase under the control of a ubiquitous promoter (human ubiquitin C promoter). Importantly, activation of Cre by exposure of Ciclox/lox; Tg.UBC-CreERT2+/T mice to 4- Hydroxytamoxifen at weaning resulted in the development of T-cell acute lymphoblastic lymphoma (T-ALL) within the first year of life. In addition, some of these mice showed associated splenomegaly caused by the infiltration of tumoral cells. These tumors overexpress the well know CIC targets Etv4 and Etv5. These results provide experimental evidence supporting a role for CIC in tumor suppression. Moreover, RNA sequencing of CicΔ2-6/Δ2-6 T-ALL tumors has allowed us to generate a CIC loss-of-function gene expression signature, that functions as readout of CIC inactivation. We have demonstrated that T-ALL driven by an oncogenic RAS show enrichment in this signature, suggesting that RAS may drive T-ALL by inactivating CIC