Unravelling the Promiscuity of Toll-like Receptor 2 and 4: New Non-Microbial Immune-Modulators and Their Mode of Recognition by TLRs

[French below]TLRs are the sentinels of our cells, they are located at the cell surface and alert the whole immune system of the presence of viruses or bacteria. They detect pathogens by recognizing their molecular patterns; this recognition is specific in order to avoid self-recognition, but they need some degree of promiscuity to remedy to pathogen heterogeneity or mutations. Promiscuity is generally defined as an indiscriminate association with molecules regardless their structure and is the contrary of specificity proper of the classic paradigm of key-lock receptor activation. My thesis results demonstrate that TLR4 and TLR2 are more promiscuous than what was believed and that this promiscuity leads to the recognition of cationic lipids and cardiolipins.Cationic lipids lipopolyamines are synthetic molecules nucleic acid nanocarriers proposed to be used for gene therapy, which consists in replacing a gene that is functioning improperly. This thesis demonstrates that lipopolyamines activate TLR2 by forming conserved and/or alternative H-bonds with TLR residues, simulating the recognition of bacterial lipopeptides and inducing pro-inflammatory cytokines secretion; which is deleterious when we aim to use these nanocarriers in the context of gene therapy. We propose the use of unsaturated cationic lipids to avoid TLR2 recognition. TLR activation could be useful instead to prepare one-component vaccine adjuvants, for which both antigen carrier and TLR activation are needed to turn on the immune system and produce antibodies. The second chapter of this thesis investigates the pro-inflammatory properties of other cationic lipids and describes new lipopolyamines able to activate both TLR2 and TLR4. The study of their adjuvanticity properties showed that they are as efficient as the aluminium salts in stimulating antibodies production.The promiscuity of TLR2 and TLR4 raised questions about the presence of endogenous TLR modulators, often countered by contamination concerns. In the third chapter, we investigate the pro- and anti-inflammatory properties of cardiolipin (CL). CL is a tetra-acylated diphosphatidylglycerol located in the inner mitochondrial membrane. Its fatty acid chain length and degree of unsaturation vary depending on species, tissue and pathological conditions. Here we show that unsaturated cardiolipin acts as a competitive TLR4 antagonist by occupying the binding site of LPS and that unsaturations discriminate between TLR4 antagonistic and agonistic activity. Under physiological conditions, mammalian CL chains are unsaturated, whereas there is an increase of saturated CL in patients affected by the Barth Syndrome. Hence we suggest that unsaturated CL could negatively regulate the inflammation during cell damage or death, via TLR4 inhibition. By contrast, saturated CLs may be involved in the inflammatory state associated with the disease. Finally, our study provides new understandings of the mechanism of TLR4 regulation and extends the library of TLR4 agonists and antagonists to molecules of easier synthesis, lower price and higher biocompatibility compared to LPS-based structures.Resumé en français Les récepteurs Toll-like (TLRs) sont des protéines transmembranaires qui constituent la première barrière de notre système immunitaire inné. Ils détectent la présence de bactéries et virus et alertent l’organisme via la sécrétion de molécules pro-inflammatoires appelés cytokines. Parmi les TLRs, TLR2 and TLR4 reconnaissent respectivement des lipides spécifiques aux bactéries, les lipopeptides et les lipopolysaccharides bactériens LPS. La reconnaissance de motifs moléculaires spécifiques aux pathogènes et absents dans notre organisme est essentiel afin d’éviter une réponse immunitaire venant du soi. Le but de notre thèse était de démontrer que les récepteurs Toll-like possèdent une certaine plasticité et peuvent reconnaître des ligands non identifiés jusqu’ici tels les lipides cationiques et la cardiolipine. Les lipides cationiques sont des molécules synthétiques utilisées comme agents de transfection. Notre travail démontre que les lipides cationiques dont la tête polaire est constituée par des polyamines peuvent mimer les propriétés des ligands naturels et induire la sécrétion de cytokines pro-inflammatoire via l’activation des TLRs. Cette interaction implique des interactions entre la chaine principale de la protéine et les lipides sans intervention des chaines latérales. Cette réaction inflammatoire est contre-indiquée en thérapie génique et nous proposons donc de remplacer les chaines acylées saturées par des chaines insaturées pour la synthèse des nouveaux agents de transfection non-immunogénique. D’autre part, l’activation des TLRs par des agents de transfections active le système immunitaire inné, ce qui permet l’activation du système adaptatif et la production d’anticorps. Nous avons étudié une large gamme des lipides cationiques et identifié des nouveaux activateurs á la fois de TLR2 et de TLR4. L’étude de leurs propriétés adjuvantes a démontré que les lipides cationiques sont des adjuvants comparables aux sels d’aluminium en terme de production d’anticorps. La cardiolipine est un lipide localisé dans la membrane des mitochondries et des bactéries. Le domaine hydrophobe est constitué de quatre chaines acylées qui chez les mammifères sont insaturées. Il a été démontré que la cardiolipine extracellulaire inhibe la sécrétion de cytokines induite par LPS. Notre travail de thèse démontre que cet effet inhibiteur est du à la capacité de la cardiolipine à bloquer le site de liaison du LPS. Le travail démontre aussi que lorsque les chaines acylées sont saturées, c’est le cas dans le Syndrome de Barth, la cardiolipine devient un activateur de TLR4 en interagissant avec TLR4 de façon similaire à LPS. Ce dernier résultat pourrait expliquer l’aspect inflammatoire du Syndrome de Barth et élargie la librairie de ligands de TLR4 á des molécules de structure plus simple et plus aisées à synthétiser que les dérivés de LPS et qui pourraient être utilisés comme adjuvants ou anti-inflammatoires.Doctorat en Sciences