Nanoencapsulation of new compounds with potentioal anti-leishmanial activity

Tese de mestrado, Química Farmacêutica e Terapêutica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Infectious diseases caused by viruses, parasites and bacteria are currently the second cause of mortality worldwide. One of these parasites is Leishmania sp., the protozoa responsible for leishmaniasis, which is highly susceptible to oxidative stress where trypanothione reductase is an enzyme that plays a crucial role in the antioxidant defense. Endoperoxide compounds such as tetraoxanes are known to be reductively activated by iron(II)–heme to form carbon-centered radicals that will create oxidative stress in the parasite. Following this concept, new tetraoxane compounds intended as antileishmanial drugs were designed and synthesized. The synthesis reaction occurred in two steps: first the suitable ketones or aldehydes were treated with hydrogen peroxide and formic acid to give the corresponding gem-dihydroperoxide; then, trans-cynnamaldehyde and Re2O7 were added to complete conversion into 1,2,4,5-tetraoxane. Two novel tetraoxanes (23 and 24) were synthesized, characterized and loaded in solid lipid nanoparticles in order to improve the targeting capacity and effective delivery to infected macrophages. These nanosystems, composed of natural triacylglycerols are among the most promising nanostructured particulate carriers with proven in vivo efficacy in the treatment of experimental leishmaniasis, while reducing adverse side effects in non-target organs. Solid lipid nanoparticles were prepared by emulsion-solvent evaporation method, using tripalmitin as the lipid component and sodium deoxycholate, Tween® 20 and lecithin as surfactants. Particle mean diameters of solid lipid nanoparticles loaded with compounds 23 and 24 were 118 nm and 125 nm, respectively. A narrow polydispersity index and a negative surface charge were achieved for both formulations, which is suitable for their physical stability and desirable for macrophage targeting. Particle mean diameter, polydispersity index and surface charge remain unchanged after storage during 20 days at 4ºC. Encapsulation efficiencies of 87% and 88% were obtained for compounds 23 and 24, respectively. The in vitro study showed a very promising activity of formulation loaded with compound 23 against leishmania infected THP-1 cells when compared with the standard anti-leishmanial drug miltefosine. Using this strategy, new therapeutically active tetraoxanes were synthesized and loaded in solid lipid nanoparticles, demonstrating their potential as anti-leishmanial agents.As doenças infeciosas causadas por vírus, bactérias e parasitas são atualmente a segunda causa de mortalidade em todo o mundo. Um destes parasitas é a Leishmania sp., o protozoário responsável pela doença leishmaniose. Embora seja reportada como a nona doença infeciosa mais grave em todo o mundo, a leishmaniose continua a fazer parte do grupo das doenças negligenciadas, afetando sobretudo as regiões equatoriais mais pobres do globo. Segundo a Organização Mundial de Saúde, 98 países são endémicos para a leishmaniose onde estão cerca de 350 milhões de pessoas em risco de contraírem a doença, gerando aproximadamente 2 milhões de novos casos todos os anos. São conhecidas mais de 20 espécies de Leishmania infeciosas para o Homem sendo as mais comuns as seguintes: L. donovani, L. infantum, L. siamensis, L. braziliensis and L. guyanensis. A doença é transmitida através da picada de uma mosca fêmea do género phlebotomine. Existem principalmente três formas de leishmaniose: i) leishmaniose visceral, que constitui a forma mais severa da doença e que tem uma taxa de mortalidade a rondar os 100% na falta de medicação adequada; ii) leishmaniose cutânea, que representa a forma mais comum da doença; iii) leishmaniose mucocutânea que é a forma mais destrutiva da doença. Durante mais de 70 anos, a primeira linha de tratamento nos países mais afetados foram os injetáveis de antimônio pentavalente (Pentostam® and Glucantime®). No entanto, este tratamento é doloroso, potencialmente tóxico, de longa duração e tornou-se ineficaz em algumas regiões, devido ao aparecimento de resistências. A pentamidina, a paromomicina e anfotericina B fazem parte dos fármacos de segunda linha usados no tratamento da leishmaniose, mas a sua utilização é limitada devido à toxicidade e também ao aparecimento de resistências. O medicamento mais atrativo e eficaz é a formulação lipídica da anfotericina B, o Ambisome®, que apesar do índice terapêutico elevado e ausência de efeitos secundários é bastante caro e, desta forma, inacessível para os países endémicos, que são na sua maioria pobres. Finalmente, o primeiro fármaco eficaz de administração oral, a miltefosina, está associada a teratogenicidade e atividade hemolítica, e o seu tempo de semi-vida é muito longo, o que pode também originar o aparecimento de resistências. Por estas razões, e na ausência de uma vacina eficaz e barata, a necessidade de novos medicamentos eficazes contra a leishmaniose é mais urgente que nunca. A Leishmania é muito suscetível ao stress oxidativo, situação em que a enzima tripanotiona redutase desempenha um papel fundamental na defesa antioxidante. Compostos com função endoperóxido como os tetraoxanos, inicialmente desenvolvidos para o tratamento da malária, são conhecidos por serem redutivamente ativados pelo ferro (II)-heme para formarem radicais centrados no carbono e espécies reativas de oxigénio (ROS) que irão criar stress oxidativo no parasita. Seguindo este conceito, foram sintetizados novos tetraoxanos destinados a atuarem como fármacos antileishmaniose através de um mecanismo de ação duplo. Sendo assim, após a ativação do tetraoxano pelo ferro (II), por quebra da ligação peroxídica, irão formar-se dois compostos: uma primeira molécula radicalar, altamente reativa, que poderá alquilar biomoléculas essenciais para a sobrevivência do parasita, ao mesmo tempo que contribui para o aumento do stress oxidativo; forma-se também uma segunda molécula com um carbonilo α,β-insaturado na sua estrutura, que funcionará como possível inibidor da enzima tripanotiona redutase. Para obtenção dos compostos pretendidos recorreu-se a um processo de síntese que ocorreu em duas etapas: em primeiro lugar compostos carbonílicos (cetonas ou aldeídos) reagiram com peróxido de hidrogénio na presença de ácido fórmico, à temperatura ambiente, para formar o correspondente gem-dihidroperóxido; de seguida este intermediário reagiu com aldeído trans-cinâmico com catálise de Re2O7, a 0oC, para completar a conversão no 1,2,4,5-tetraoxano. Dois novos tetraoxanos (23 e 24) foram assim sintetizados, purificados e caracterizados. O rendimento final da reação de síntese do composto 23 foi de 71% e o do composto 24 foi de 47%. Ambos os compostos foram caracterizados por ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN), de carbono (13C-RMN) e por técnicas bidimensionais (COSY, HMQC, HMBC), espectroscopia de infravermelho, análise elementar e ponto de fusão. Os valores de análise elementar estão de acordo com os valores teóricos calculados e os pontos de fusão são 132-135oC e 96-100oC para os compostos 23 e 24, respetivamente e foram concordantes em duas técnicas diferentes (método de fusão instantâneo e DSC). Desde que foram descritas, no início dos anos 90, as nanopartículas lipídicas sólidas são vistas como uma excelente alternativa, eficaz e não tóxica, aos transportadores de fármacos coloidais mais conhecidos, como por exemplo, os lipossomas. As nanopartículas lipídicas podem ser preparadas com lípidos normalmente utilizados como excipientes farmacêuticos. As duas primeiras formas de produção destes transportadores foram a homogeneização a alta pressão e a microemulsão. A natureza coloidal e de libertação controlada permitem a proteção dos fármacos encapsulados pelas nanopartículas lipídicas sólidas, e a administração parentérica e não parentérica. Estes nano-sistemas combinam as vantagens dos lipossomas e das nanopartículas poliméricas numa só tecnologia farmacêutica. Os novos tetraoxanos foram então encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas, com o objetivo de melhorar a veiculação controlada e direcionada até aos macrófagos infetados. Estes nano-sistemas, constituídos por triacilgliceróis naturais estão entre os veículos mais promissores, com eficácia comprovada in vivo no tratamento da leishmaniose, reduzindo os efeitos secundários em órgãos não infetados. As nanopartículas lipídicas sólidas foram preparadas pelo método de emulsão e evaporação de solvente, utilizando a tripalmitina como componente lipídica e o desoxicolato de sódio, Tween® 20 e lecitina como tensioativos. O diâmetro médio das partículas para as formulações com os compostos 23 e 24 encapsulados foi de 118 nm e 125 nm, respetivamente. Foi obtido um índice de polidispersão baixo e potencial zeta negativo para ambas as formulações. Estes valores são adequados para a sua estabilidade física, e desejáveis para vectorização para os macrófagos. O diâmetro médio das partículas, o índice de polidispersão e o valor de potencial zeta permaneceram inalterados após o armazenamento durante 20 dias a 4ºC. Após esterilização por autoclave o diâmetro médio das partículas baixou consideravelmente, assim como a carga de fármaco. Este fenómeno foi identificado por DLS, uma vez que quando a temperatura se elevava acima do ponto de fusão da tripalmitina os tetraoxanos saíam do interior da matriz lipídica, resultando na redução do diâmetro médio das partículas. Foram obtidas eficiências de encapsulação de 87% e 88% para os compostos 23 e 24, respetivamente. Os estudos de libertação comprovaram que a formulação com o composto 23 é mais estável aos valores de pH testados (7.4 e 1.0) mas que ambas têm de ser melhoradas de forma a aumentar a gastro resistência, uma vez que estas formulações têm como fim a administração oral. Os estudos de viabilidade celular mostraram que ambos os compostos não têm toxicidade associada. O estudo in vitro em células THP-1 infetadas com L. infantum revelou atividade bastante promissora, do composto 23 encapsulado, quando comparado com a miltefosina (fármaco aprovado com atividade antileishmaniose). Esta estratégia permitiu a descoberta de novas formulações lipídicas com tetraoxanos encapsulados, como potenciais candidatos a fármacos contra a leishmaniose