Characterization Of Pathogenicity Traits And Trichothecene Production In The Wheat Pathogen Fusarium Culmorum

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2014Fusarium culmorum tek hücreli bir ipliksi mantardır ve en çok bitki patojeni olmasıyla tanınır. Genomu henüz sekanslanmamıştır ve bu nedenle bir çok genin işlevi ve patojenik özellikleri detaylı olarak bilinmemektedir. Mısır ve buğday gibi küçük tohumlu tahılları enfekte edebilen F. culmorum, özellikle buğdayda kök ve kökboğazı çürüklüğü, buğday başak yanıklığı gibi bir çok hastalığa neden olabilir. Bu hastalıklar sonucu buğday tohumlarında beyaz renkli fenotip, buruşuk taneler, kısırlık gibi problemler görülür. Bu durum ise üretimde verimin ve kazancın ciddi miktarda düşmesine neden olmaktadır. Bunun haricinde, F. culmorum tarafından enfekte edilmiş bitkilerde, mantarlar tarafından sentezlenen ve salgılanan mikotoksinlerin birikimi gözlenmektedir. Mikotoksinler, Fusarium türleri tarafından üretilen ikincil metabolitlerdir ve binlerce farklı çeşidi bulunmaktadır. Temel olarak Fusarium türleri tarafından üretiken mikotoksinler trikotesen ve fumonisin olarak iki gruba ayrılırlar. Mikotoksinler bitkiler üzerinde üretilir, birikir ve bitkiler yoluyla insanlar ve diğer hayvanlara geçerler. Trikotesenler ökaryotlarda protein sentezini inhibe edebilirken, fumonisinler sfingolipid üretimine engel olarak insan ve hayvanların sağlığını tehdit ederler.F. culmorum B tipi trikotesenler olan deoksinivalenol (DON), 15-asetildeoksinivalenol (15-ADON), 3-asetildeoksinivalenol (3-ADON) gibi mikotoksinleri üretebilmektedir. Bu mikotoksinlerin üretimi trikotesen yol izi ile gerçekleşir. Bu yolizinde 14 gen tarafından üretilen farklı proteinler yer almaktadır. Tek bir molekül farnesil pirofosfatın (FPP) girdiği tepkimeler serisi sonucu toksinler üretilir. Toksinlerin üretimini engellemek ya da azaltmak amacıyla fenolik bileşikler kullanmak çözüm yollarından biridir. Bu tezin amacı, F. culmorum’un patojenik özelliklerinin genetik karakterizasyonunun yapılmasıdır. Bu amaçla, tezin ilk kısmında, fonksiyonu bilinmeyen üç genin işlevi, önceden elde edilmiş delesyon mutantları ve ektopik türler kullanılarak araştırılmıştır. Tüm türler öncelikle 2M Sorbitol, 1M NaCl, 0.02% SDS, 0.5 ppm Tebuconazol, 30mM K2S2O8, sıcak (37°C) ve soğuk (8°C) stresleri varlığında fenotipik olarak test edilmiş ve büyüme miktarları kaydedilmiştir. Ardından patojenitelerindeki değişikliğin tespiti için, miseller üzerine yerleştirilen buğday tohumlarının filizlenmeleri gözlemlenmiştir. FGSG_08817 geninin araştırılmasında 2 ektopik, 4 delesyon türü kullanılarak fenotip ve patojenite testleri yapılmıştır. Büyüme miktarları yaban tip ile kıyaslandığında, delesyon mutantlarının oluşan streslere karşı daha dayanıklı ya da zayıf olduğu görülmemiş, patojenite ise değişmemiştir. FGSG_16588 geni araştırılırken, önceden elde edilen bir delesyon mutantı ve bir ektopik tür incelenmiştir. Bu türlere yapılan testler sonucu, delesyon mutantının stres koşulları altında yaban tip ile aynı şekilde ürediği, buğday patojenitesinin de benzer şekilde kaldığı görülmüştür. Ancak bu genin, 8-E olarak adlandırılan ektopik türünde NaCl ve sorbitol varlığında daha fazla üreme görülmüştür. NaCl ve sorbitol test edilen konsantrasyonlarda ortamda bulunduklarında hücrelerde ozmotik strese neden olurlar. Sonuç olarak 8-E ektopik türün ozmotik strese direnç kazandığı görülmüştür. Patojenite testlerinde ise 8-E’nin patojenik özelliklerinin arttığı görülmüştür. Ektopik türde istenilen gen silinmediğinden bulgular genin fonksiyonları ile ilişkilendirilmemiştir. Üçüncü incelenen gen FGSG_16572 beş farklı delesyon mutantı kullanılarak fenotipik ve patojenik testler yardımıyla araştırılmıştır, ancak bu genin de patojeniteyle ilintili olmadığı ve test edilen stres koşullarına direnç sağlamadığı görülmüştür. Tezin ikinci kısmında ise, fenolik bileşiklerin F. culmorum’un mikotoksin üretimine etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla ferülik asit ve dimerik ferülik asit bileşiklerinin, bunların yanı sıra, isimleri patent başvurusu sebebiyle gizli tutulan ve bileşik 1, 2, 3 ve 4 olarak adlandırılan dört farklı fenolik bileşiğin F. culmorum üzerindeki etkileri gen anlatım, hücresel üreme ve toksin üretim düzeylerinde test edilmiştir. Kimyasallar, toksin üretimini tetikleyen Vogel besiyerine, çözünmeyi arttırması için beta siklodekstrin ilavesiyle eklenmiştir. Tüm bileşikler 0.25mM konsantrasyon ile test edilmiştir. Bileşik 4 için 0.10mM ve 0.05mM konsantrasyonları da araştırmaya katılmıştır. Belirtilen besiyerlerinde 5 gün boyunca üreyen hücrelerden 3 biyolojik tekrar ile örnekler toplanıp, sıvı azot ile hücreler parçalanmış, RNA izole edilip, tüm RNAlar cDNA’ya çevrilmiştir. cDNA’lar kullanılarak trikotesen yolizinde yer alan FPP, TRI5, TRI4, TRI11, TRI3, TRI13, TRI6 ve TRI10 genlerinin anlatım düzeyleri Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile belirlenmiştir. ΔΔCT yöntemi ile yorumlanan sonuçlar, kontrol grubunda araştırılan genin anlatımı 1 olarak kabul edilerek düzenlenmiştir. Ferülik asit, literatürdeki sonuçlarla uyumlu olarak, test edilen genlerin anlatımını 0.6-0.8 düzeyinde azaltan bir etki göstermiştir. Dimerik ferülik asidin 0.25mM konsantrasyon ile varolduğu ortamda üreyen hücrelerin genanlatımlarının 0.5-0.8 arasında olduğu görülmüştür. Bileşik 1’in varlığı kimi genlerin anlatımlarında artışa neden olurken, bazılarında değişiklik gözlemlenmemiştir. Bileşik 2, test edilen genlerin büyük bir çoğunluğunun anlatımının yaklaşık iki kat daha fazla artmasına neden olmuştur. Bileşik 3’ün ise 0.25mM konsantrasyonda 0.6-1.0 arasında değişen, çoğunlukla azalmış gen anlatımına sebep olduğu görülmüştür.Bileşik 4’ün test edilen üç farklı konsantrasyonu karşılaştırıldığında, 0.25mM ve 0.10mM konsantrasyonlarda, FPP dışındaki trikotesen yolizi genlerinin tümünün anlatımlarının azaldığı gözlemlenmiştir. 0.05mM konsantrasyonun gen anlatımlarını, diğer yüksek konsantrasyonlara kıyasla daha az etkilediği görülmüştür. Yalnızca gen anlatım değerleri üzerine yapılan birincil yorumlarda bileşik 4’ün 0.10mM’ının gen anlatımını azaltmaya yeterli olduğu belirtilmiştir. Gen anlatımlarındaki etkileri test edilen tüm bileşiklerin toksin üretim ve hücre üremesiüzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, Vogel besiyerinde gen anlatımı için bahsedildiği şekilde, 5 biyolojik tekrar ile hazırlanan hücreler 14. gün sonunda toplanmıştır. Sıvı kısımdan toksinler ayrılarak sıvı kromatografi-kütle spektrometri (LC-MS)yöntemi ile analiz edilmiştir. Hücrelerden oluşan katı kısım ise kurutularak tartılmıştır. 0.25 mM ferülik asidin hücre üremesini fazla engellemediği, ancak toplam toksin üretimini %30’a kadar düşürebildiği görülmüştür. Gen anlatım sonuçları ile tutarlı olan toksin analizi, ferülik asidin başarılı bir inhibitör olduğunu göstermiştir. Aynı konsantrasyondaki dimerik ferülik asidin de hücre üremesine etkisinin az olduğu görülmüştür. Her ne kadar test edilen genlerin anlatımları bu kimyasalın varlığında azalmış olarak bulunmuş olsa da, dimerik ferülik asidin toksin üretimini %380 oranında arttırdığı görülmüştür. Bileşik 1’in test edilen konsantrasyonda hücre üremesine etkisi olmadığı görülmüştür. Gen anlatım düzeylerinin azalmış olmasına rağmen, toksin üretiminin %130 civarında olduğu tespit edilmiştir. Bileşik 2 hücre üremesini %20 oranında azaltmış ve test edilen kimyasallar arasında en etkili mantar ilacı olarak belirlenmiştir. Toksinler bu kimyasalın varlığında % 40 oranında üretilebilmiştir. Bileşik 3 varlığında hücrelerin üremesi yaklaşık %80 olarak görülmüştür. Bu bileşik, test edilen konsantrasyonda, toplam toksin üretimini %35 azaltmıştır ve bu sonuçlar, gen anlatım sonuçları ile tutarlı bulunmuştur. Bileşik 4’ün üç farklı konsantrasyonu olan 0.25mM, 0.10mM ve 0.05mM varlığında toksin üretimlerinin, bileşiğin konsantrasyonuyla ters orantılı olarak azaldığı görülmüştür. Test edilen en yüksek konsantrasyonda toplam toksin üretimi %33 olarak bulunmuştur. 0.10mM konsantrasyonda toksinlerin %43 miktarında üretildiği, 0.05mM konsantrasyonda ise üretimin %47 oranında gerçekleştiği gösterilmiştir. Bulunan bu sonuçlar, gen anlatım sonuçları ile uyumlu görünmektedir. Test edilen fenolik bileşiklerden istenilen sonuca benzer sonuçlar veren ferülik asit, bileşik 2 ve bileşik 4 için in planta deneyler önerilmiştir.Fusarium culmorum is a soil-borne plant pathogen and it is a very important factor in the development of diseases Fusarium Head Blight (FHB), Foot and Root Rot (FRR) and Crown and Foot Rot (CFR) in small grain cereals such as wheat and maize, leading to important yield losses. During infection, F. culmorum produces a wide range of mycotoxins, such as trichothecenes, which accumulate on the plant. These mycotoxins can also cause serious diseases in humans and animals when consumed alongside the cereals. Even though F. culmorum is an important concern worldwide, the whole genome of this fungus has not been sequenced yet. There are several possibilities to prevent fungal growth and mycotoxin production on plant. It was previously shown that application of phenolic compounds on the plants leads to less mycotoxin production, even though the mechanisms are unknown. The aim of this thesis is to investigate the mechanisms of pathogenicity of F. culmorum and investigate the effects of several phenolic compounds on mycotoxin production of the fungus. Firstly, three genes with unknown function; FGSG_08817, FGSG_16572 and FGSG_16588 were investigated through previously obtained knock-out mutants. These mutants were studied under cell wall, osmotic, oxidative and thermal stress conditions and it was shown that tested genes were not related to mechanisms which the cells require to cope with these stresses. In vitro pathogenicity tests were also carried out for these strains and it was established that these genes do not affect the pathogenicity of the fungus. Additional experiments were carried out where the fungus was grown in Liquid Vogel’s medium in the presence of phenolic compounds ferulic acid (0.25mM) and ferulic acid dimer (0.25mM), as well as four other phenolic compounds referred to as compound 1 (0.25mM), compound 2 (0.25mM), compound 3 (0.25mM) and compound 4 (0.25mM, 0.10mM, 0.05mM). All media were prepared with beta-cyclodextrin (3mM) to enhance solubility. Gene expression levels of five day old mycelia were tested by Quantitative Real Time PCR. Genes regarding trichothecene production pathway; TRI5, TRI4, TRI11, TRI3, TRI13, TRI6, TRI10 and FPP were tested with 18S gene as the reference. Fourteen day old mycelia were separated from the liquid media, dried and weighed; whereas the liquid portions were tested by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method to establish the amount of toxins produced by the fungus. It was observed that the presence of ferulic acid and compound 2 leads to downregulation of trichothecene pathway genes and toxin content. Ferulic acid dimer led to downregulation of tested genes, but the toxin production increased. Compound 1 led to increase in both gene expression and toxin levels. Compounds 3 and 4 both led to downregulation of the genes and inhibition of toxin production. For three concentrations tested in compound 4, it was found that 0.25mM and 10mM concentrations were sufficient to downregulate gene expression levels, whereas 0.05mM of the compound was not sufficient to decrease them. However, all three concentrations of compound 4 led to inhibition of toxin production, where higher concentrations of the compound decreased toxin production more effectively.Yüksek LisansM.Sc