Increasing The Substrate Specificity Of Geobacillus Stearothermophilus Ldh By Using Iterative Saturation Mutagenesis

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016Hidroksi asitler (HA), yapılarında karbonil ve hidroksi gruplarını barındıran organik asitlerdir. Bu organik asitler; α-hidroksi asit (AHA), β-hidroksi asit (BHA), salisilik asit (SA) ve polihidroksi asit (PHA) olmak üzere dört (4) sınıfa ayrılır. Hidroksi asitlerin özellikle de AHA‟lerin endüstride kullanımı gün geçtikçe artmaktadır. AHA‟lerin dermatolojik olarak yapıcı etkilerinin olması, kozmetik-kişisel bakım ürünlerinin temel bileşenlerinden olması ve ilaç sanayisi için ara ürünlerin üretiminde kullanılmaları nedeniyle endüstriyel biyoteknoloji için vazgeçilmezdirler. AHA‟lerin üretimi için organik sentez kullanılan eski yöntemlerden biridir. Çünkü günümüz yeşil teknoloji devridir ve endüstriyel işlemlerde kullanılan kimyasalların yerini enzimler almış durumdadır. Kiral AHA‟ler, enzimlerin biyokataliz olarak kullanıldığı endüstriyel biyoteknolojik işlemlerle de elde edilirler. Biyokatalizörler kimyasal katalizörlerle kıyaslandığında; daha az maliyetli koşullarda farklı stereoselektif ve rejioselektif transformasyonları katalizleyebilmesi gibi avantajlar sağlamaktadır. Ancak, enzimlerin endüstrinin aşırı (asidik/bazik ve düşük/yüksek sıcaklık) koşullarına dayanıklı olmamaları ve çok az sayıda kimyasalı substrat olarak kabul etmeleri nedeniyle, endüstriyel öneme sahip kiral AHA‟lerin tek enantiomer olarak kemoenzimik üretimi çok sınırlı olmuştur. Enzimlerin bu dezavantajları yüzünden modifiye edilerek endüstride kullanıma uygun hale getirilmeleri gerekmektedir. Bu modifikasyonların gerçekleştirilmesi için protein mühendisliği tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadır. Enzimler endüstriyel prosesler için modifiye edilirken; rasyonel tasarım (mantıklı tasarım/akılcı tasarım) metodu ile mutasyonlar tasarlanır. Ancak, ilgilenilen enzimle ilgili çok detaylı yapı bilgisi gerektirmesi, oluşturulacak yararlı mutasyon (lar) un belirlenmesi için uzun süreli çalışmalara ihtiyaç duyan deneysel-hesapsal bilgiler gerektirmesi bu metodun en büyük dezavantajları olarak sıralanmaktadır. Öte yandan, rekombinant deoksiribonükleik asit (DNA) teknolojisinin gelişmesiyle; mevcut rasyonel tasarım metoduna alternatif yeni metotlar geliştirilmiştir. En yaygın kullanılan metot ise ilgilenilen enzimde çeşitli tekniklerle (hata yapabilen (errorprone) polimeraz zincir reaksiyonu (EP-PCR), karma DNA (DNA shuffling) gibi) rastgele mutasyonlar oluşturulması ve elde edilen içeriği 103-106 arasında olan mutant kütüphanesinden, istenilen özelliklere sahip mutant enzimlerin seçilmesi olarak uygulanan iki basamaklı yönlendirilmiş mutasyon teknolojisidir. Bu yöntemde ilgilenilen enzimin bütün amino asitlerinin hedef olarak seçilmesi ve mutasyonun bu amino asitler üzerinden rastgele oluşturulması nedeniyle anlamsız birçok mutantı içeren büyük bir mutant kütüphanesi elde edilmektedir. Bu kütüphane içerisinde, hedef olarak seçilen özelliklere sahip mutant enzimin seçilmesi için etkili, verimli ve kısa sürede sonuç verecek bir seçme tekniğine ihtiyaç duyulmaktadır. İstenilen özellikleri taşıyan mutant koloninin binlerce koloni içerisinden seçilebilmesi için; istenilen özellikleri taşıyan hedef mutant koloniye özgü bir seçme tekniğinin xxiv olmayışı bu metodun en büyük dezavantajıdır. Ayrıca, sayıca çok büyük ve zengin mutant kombinasyonlarını içerecek bir kütüphane oluşturmak için uzun süreler gerektiren protokol iyileştirmelerine ve sonrasında seçme kısmında çok fazla laboratuvar çalışmasına/robotik teknolojilere ihtiyaç duyulmaktadır. Çalışmada, endüstriyel uygulamalarda AHA‟lerin üretimini sağlamak için termal dayanımı yüksek olması nedeniyle bsLDH enzimi kullanılmıştır. Yabanıl tip (WT) bsLDH, indirgenmiş kiral AHA‟lerden sadece laktatın üretilmesini katalizlemektedir. Piruvat ve laktat arasındaki reaksiyonu, NADH/NAD+ kofaktörlerini kullanarak katalizler. Reaksiyonu yüksek özgüllükte gerçekleştirir. Bu da endüstride kiral madde kullanımına ihtiyaç duyan alanlarda avantaj sağlayabilir. bsLDH‟ın termal dayanımının yüksek olmasına rağmen substrat aralığının dar olması bu enzimin kullanımı için bir dezavantaj oluşturmaktadır. Bu nedenle, farklı kiral AHA‟leri substrat olarak tanıyacak bsLDH için enzim mühendisliği uygulamalarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, enzimin substrat aralığının artırılması için alternatif protein mühendisliği yöntemi olan “Tekrarlamalı Doygunluk Mutagenez” (ISM) metodu kullanılmıştır. ISM, sadece deneysel ve hesapsal çalışmalarla daha önceden fonksiyonel olduğu belirlenmiş ya da fonksiyonel olma potansiyeline sahip az sayıdaki amino asit pozisyon (lar) ına odaklanır. Sonra aday amino asit pozisyon (lar) ı üzerinden sınırlandırılmış mutasyonlar içeren mutant kütüphaneleri oluşturulur. Sadece az sayıda fonksiyonel amino asit pozisyon (lar) ı hedef alması nedeniyle; oluşturulan mutant kütüphanesi, sayısal olarak yönlendirilmiş mutasyon teknikleri ile elde edilen kütüphanelere göre çok daha küçüktür. Her aday kütüphaneden en iyi mutantı seçerek, hedef mutant enzim için kombinasyon yapar. Aynı şekilde ISM en iyi hedef mutant enzim elde edilinceye kadar tekrarlanır. Dolayısıyla, ISM seçme basamağındaki çalışmaları büyük oranda azaltmakta ve istenilen özelliklere sahip mutantın elde edilmesini çok daha fazla mümkün kılmaktadır. Enzimlerin substrat aralığını genişletmek için; ISM metodu, kombine aktif bölge doyurulmuş test (CAST) tekniği ile (ISM/CAST) elde edilen bölgelere uygulanmaktadır. CAST rasyonel tasarım ve rastgele protein tasarım yöntemlerinin avantajlarını kullanarak; enzimin üç boyutlu (3D) yapı bilgisine (X-ışını yada homoloji modelleme yöntemiyle elde edilmiş) ve yapısıyla ilgili yapılmış çalışmalardan elde edilen bilgilere dayanarak; bağlanma bölgesine yakın bir yada daha fazla amino asit pozisyonundan oluşan bölgeleri belirler. İlgilenilen pozisyon ya da bölge, enzimin substrat tanımada etkili olduğu düşünülerek seçilir. Bu nedenle CAST tekniğinde doğru amino asit pozisyonlarını seçmek çok önemlidir. Tezin amacı, endüstriyel öneme sahip hedef kiral AHA‟leri substrat olarak kullanabilen yeni mutant bsLDH enzimini üretebilmektir. Bu nedenle, yeni biyokatalizörleri elde etmek için daha küçük ve fonksiyonel kütüphaneler kuran yarı rasyonel tasarım metodunun kullanılmasıyla bsLDH enziminin yeniden tasarlanması amaçlanmıştır. Bu çalışmada, altı (6) mutant kütüphanesi, bsLDH‟ın substrat çeşitliliğinin artırılması için oluşturulmuştur. Kütüphaneler oluşturulurken NRT dejenaratif kodon kullanılmıştır. Bu kodon 8 amino asidi (arjinin, asparajin, aspartik asit, sistein, glisin, histidin, serin, tirozin) kodlar. Kodlanan amino asitler ile oluşturulan kütüphaneler daha küçük ve zengin içeriğe sahiptir. Oluşturulan kütüphanelerin okzalasetat, fenilpiruvat, benzoilformata karşı taramaları yapılmış ve sekiz (8) LDH varyantı tanımlanmıştır. Bu varyantların hedef olarak seçilen α-keto asitlere (okzalasetat, fenilpiruvat, benzoilformat) karşı iyileştirilmiş aktiviteye sahip oldukları görülmüştür. Aktif mutantların kinetik karakterizasyonları, bsLDH‟ in xxv doğal substratı olan piruvat ve hedef substratlara karşı çalışılmış ve yabanıl tip bsLDH ile karşılaştırmaları yapılmıştır. Tüm bu çalışmalar sonunda, hedef substratlara karşı aktif olarak N101R102, D101Y102 ve N101C102 şeklinde isimlendirilen üç mutant elde edilmiştir. Okzalasetata karşı elde edilen N101R102 mutantı, WT bsLDH ile karşılaştırıldığında kinetik parametreleri arasında çok fark olmadığı fakat mutantın az da olsa bir iyileştirme gösterdiği görülmüştür. Bir diğer mutant olan D101Y102‟ nin fenilpiruvata karşı ilgisi (KM) beş kat azalma gösterirken, turnover sayısında (kcat) beş kat artış görülmüş bunun sonucunda WT ile benzer kcat/KM oranına sahiptir. Benzoilformata karşı aktivite gösteren N101C102 mutantının ise, WT ile karşılaştırıldığında kcat/KM oranının 2.5 kat daha aktif olduğu tespit edilmiştir. Literatür çalışmalarında benzoilformatı substrat olarak kullanan bir çalışma olmaması da bu mutantın önemini artırmıştır. Bu proje kapsamında elde edilmiş olan mutantların, kiral AHA‟ lerin biyoteknolojik olarak üretilmelerinde faydalı biyokatalizörler olabileceklerine inanılmaktadır.Importance of chiral α-hydroxy acids (AHAs) are steadily increasing more in particular for the production of pharmaceutical and cosmetic dermatology. AHAs are indispensable for biotechology due to their importance in the production intermediate component for pharmaceutical industry. They are the main components of cosmetic-personal care product and also they have dermatological constructive effects. Chiral compounds are produced by using enzymes as biocatalyst in industrial biotechnological processes. However, enzymes are not stable under harsh conditions of the industry and recognizing a very small number of chemicals as substrate that has been limited the kemoenzimic production of industrially important chiral AHAs as a single enantiomer. Wild type Geobacillus stearothermophillus lactate dehydrogenase (bsLDH) can catalyze only the production of lactate from reduced chiral AHA. Therefore, enzyme engineering applications are needed for bsLDH which will recognize different chiral AHAs as substrate. In the proposed project, due to the high thermal resistance of bsLDH enzymes have been used. In this study, Iterative Saturation Mutagenesis (ISM) was used in order to expand the substrate range of the enzyme. ISM, only focuses on amino acid position(s) of enzyme defined by experimental or computational studies functional or amino acid position(s) having potential of being functional. Then, ISM forms mutant libraries which is limited with mutations based on candidate amino acid position(s). Due to targeting a few number of selected functional amino acids, formed mutant libraries by ISM are numerically much smaller than obtained libraries by directed mutations techniques. By selecting the best mutant from each mutant candidate library, ISM makes combinations for target mutant enzyme. Thus, ISM was repeated until obtaining the hit target enzyme. So ISM reduces studies in the selection steps in a huge rate and makes much more possible to obtain mutants having the desired properties. In this project, we aimed to produce bsLDH for introducing different industrially important target AHA as a substrate. For this purpose six mutant libraries were designed in an effort to expand the substrate range of bsLDH. The eight variants were identified as having enhanced activity toward the selected α-keto acids (oxaloacetate, benzoylformate, phenylpyruvate), belongs to the same library. These new variants now may be useful biocatalysts for chiral synthesis of α-hydroxy acids.Yüksek LisansM.Sc