Tez Başliği (ingilizce): Physiological Analysis Of Cobalt-resistant Rhodobacter Sphaeroides Obtained By Evolutionary Engineering

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015Rhodobacter sphaeroides kükürtsüz, mor, α-proteobakteri grubuna ait gram negatif bir bakteridir. Metabolik olarak çok çeşitli reaksiyonlar gerçekleştirebilen R. sphaeroides; fotoheterotrofik, fotoototrofik, kemoheterotrofik koşullarda yaşamını sürdürebilir; çamur, toprak, durgun sular, derin göller gibi çeşitli ortamlarda bulunabilir. Bulunduğu ortamdaki karbon kaynaklarının ve diğer besiyeri bileşenlerinin eksikliğinde, çeşitli çevresel stres koşulları altında gerekli metabolik yolakları aktive ederek canlılığını sürdürür. Sekanslanmış genomu, kompleks koşullara gereksinimi olmadan basit ortamlarda üreyebilme yeteneği ve en önemlisi sahip olduğu çok yönlü metabolizma, bu bakterinin biyoteknolojik açıdan oldukça ilgi çekici olmasının başlıca nedenlerindendir. Günümüzde oldukça geniş kullanım alanına sahip plastikler, çoğunlukla petrolden elde edilir ve üretilen bu sentetik polimerler doğada uzun yıllar kalıntı bırakarak toksik madde birikimine neden olur. Bu yüzden sentetik polimerlere alternatif olarak günümüzde doğada çözünebilen, biyouyumlu, yenilenebilir biyoplastiklerin üretimi ve kullanımı önem kazanmaya başlamıştır. R. sphaeroides, biyolojik olarak parçalanabilen bir poliester olan polihidroksibütiratı (PHB) sentezleyebilme yeteneğine sahiptir. Hücre içi depo granülü olarak sentezlenen ve depolanan PHB’nin, R. sphaeroides tarafından büyük ölçekte üretilerek endüstriyel uygulamalarda kullanım potansiyeli vardır. PHB’nin yanısıra R. sphaeroides endüstriyel ve medikal öneme sahip bir çok ürün sentezleyebilir. Bunlara örnek; kalp hastalıklarının tedavisinde ve kozmetik endüstrisinde sıkça kullanılan koenzim Q10, kanserli hücrelerin takibini sağlayan 5-aminolevulinik asit, çeşitli ilaçların etken maddesi ya da besin katkı maddesi olarak kullanılabilen B12 vitamini, hayvan besin katkısı ya da gıda renklendirici olarak kullanılan karotenoidler, organik kirleticilerin ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan çinko sülfit nanopartiküller ve bitki hormonları verilebilir. Ayrıca, organik sübsratları kullanarak temiz ve yenilenebilir bir enerji kaynağı olan biyohidrojenin üretimini sağlayabilmektedir. Sentezleyebildiği yan ürünlere ek olarak, toksik metal birikimi olan çevrelerde biyoremediasyonu gerçekleştirebilmesi, R. sphaeroides’in biyoteknolojik önemini oldukça arttırmaktadır. Mikroorganizmaların metal stresi altındayken canlı kalmak için aktive ettiği enzimatik detoksifikasyon, hücre dışında metalin tutulması ya da daha az toksik forma çevrilmesi, hücre içinde metalin proteinlere bağlanarak tutulması veya hücre dışına aktif metal taşınımı gibi çeşitli direnç mekanizmaları vardır. R. sphaeroides, metabolizmasındaki çeşitlilik sayesinde gerektiğinde uygun metabolik yolakları aktive edip, hücresel ve genetik yapısında değişiklikler geçirerek çok farklı stres koşullarına direç sağlayabilmektedir. Bu değişikliklere örnek, ağır metallere maruz kalan R. sphaeroides hücrelerinin membran bütünlüğünün arttırılması ya da oksidatif stres altındaki hücrelerde karotenoid sentezinden sorumlu genlerin regülasyonunun azalması verilebilir. Kobalt, organizmaların metabolik aktiviteleri gerçekleştirebilmeleri ve yapısal organizasyonu sağlayabilmeleri için gerekli olan, eksikliğinde ya da fazlalığında toksik etkilere yol açan esansiyel bir iz elementtir. Kobalt, B12 vitamininin yapısında bulunur, ayrıca transkarboksilaz ve aminido aspartaz gibi bazı enzimlerinin çalışabilmesi için gereklidir. Fakat yüksek konsantrasyonlarda hücresel solunumu ve sitrik asit çevriminde görevli enzimleri inhibe ederek hücreler için toksik etki yapar. Bakterilerde yüksek kobalt konsantrasyonu oksidatif stresi arttırarak ya da iyon geçişinin modifikasyonuna neden olarak bazı makromoleküler özelliklerin düzeltilmesini engeller. R. sphaeroides çok yönlü metabolizması sayesinde yüksek kobalt konsantrasyonunda kobaltı hücre yüzeyinde biriktirerek yaşamını sürdürebilir. Bu tez çalışmasında kullanılan R. sphaeroides bakterisi, evrimsel mühendislik çalışmasıyla elde edilmiş olup, kobalt konsantrasyonu aşama aşama arttırılarak kobalta dirençli hale getirilmiştir. Başlangıçta uygulanan CoCl2 konsantrasyonu 0.1 mM iken, 64. popülasyonda 15 mM stres uygulanmıştır. Bu sayede referans suşun hayatta kalamadığı kobalt konsantrasyonunda yaşayabilen bir popülasyon elde edilmiştir. 64. popülasyonun hayatta kalma yüzdesi % 21 gibi yüksek bir değer olmasına rağmen, artan konsantrasyonlarda kobaltın çökerek birikim yapması nedeniyle spektrofotometrik ölçüm yapılması zorlaşmıştır. Bu yüzden bu popülasyon son popülasyon olmuştur ve seyreltilip katı LB besiyerine ekilerek bu besiyerinden 8 koloni seçilmiştir. Kırmızı rengin farklı tonlarına sahip koloniler; G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 ve G8 olarak isimlendirilmiş ve çeşitli metodlarla bu mutant bireylerin fizyolojik analizleri gerçekleştirilmiştir. Referans suş için tarama testi, referans suşun hayatta kalabildiği en yüksek kobalt seviyesini belirleyebilmek için, optik yoğunluğun 535 nanometrede ölçümü ve ölçümler sırasında hücrelerin katı besiyerine üçlü tekrarlar halinde ekilmesi ile hücre sayımı yapılarak gerçekleştirilmiştir. Yüksek kobalt konsantrasyonunda çalışılırken kobalt çöktüğünden dolayı, optik yoğunluk ölçümleri çok doğru sonuç vermese de, hücrelerin katı besiyerinden ekimleri sonucunda alınan veriler grafiğe dökülerek 5 mM kobalt konsantrasyonunda hücrelerin hayatta kalma oranının en yüksek seviyede olduğu saptanmıştır. Ayrıca 12.5 mM CoCl2 konsantrasyonunda bile çok düşük olsa da yaşayabilen hücrelerin varlığı tespit edilmiştir. Seçilen sekiz mutant bireyin kobalt stresine karşı direncini ölçmek için Most Probable Number (MPN) ve damlatma (spot) testleri gerçekleştirilmiştir. R. sphaeroides bakterisi çok kolay kontaminasyona uğradığından, G2’nin katı besiyerine ekim sonucuna göre kontaminasyona uğramış olabileceği şüphesinden dolayı G2 sonraki deneylerde yer almamıştır. MPN sonuçlarına göre mutant bireylerin en iyi ürediği kobalt konsantrasyonu 4 mM’dır. Damlatma testine göre, 1 mM CoCl2 konsantrasyonu içeren katı LB besiyerlerinde tüm mutant bireyler ve referans suşu aynı oranda büyüyebilmekte iken, 2 mM’dan itibaren referans suş kobalta direnç gösterememeye başlamıştır ve 3.5 mM ile üzerindeki konsantrasyonlarda hiç üreyememiştir. Çapraz direnç testinde, kobalta direnç geliştirmiş olan bireylerin başka hangi stres türlerine karşı direnç kazanmış olabilecekleri incelenerek karşılaştırma yapılmıştır. Bunun için; nikel (ІІ) klorür (2 mM, 2.2 mM, 2.4 mM), etanol (8% v/v), sodyum klorür (0.5 M), alüminyum klorür (5 mM), bakır (ІІ) klorür (0.5 mM), magnezyum klorür (500 mM, 750 mM, 1M), hidrojen peroksit (1 mM, 2 mM), demir (ІІ) klörür (4 mM, 5 mM), mangan (ІІ) klorür (10 mM), borik asit (30 mM, 50 mM), kafein (20 mM), amonyum demir (II) sülfat (5 mM) ve çinko klorür (1 mM) kullanılmıştır. Testin sonucuna göre, direnç dereceleri diğer kolonilere göre daha yüksek olan G4, G6 ve G7 bireyleri, sonraki deneylerde incelenmek üzere seçilmiştir. Bunun yanı sıra, G7’nin nikel, borik asit, kafein ve magnezyum stresine karşı gösterdiği yüksek direnç kapasitesi, çapraz direnç testinin en önemli bulgularındandır. Genetik kararlılık testinde; G4, G6 ve G7’nin kobalta karşı kazandığı direncin geçici olup olmadığı MPN yöntemiyle araştırılmıştır. On gün boyunca hücrelerin strese karşı direnç düzeyleri MPN ile incelenmiştir, fakat R. sphaeroides için bu yöntem çok güvenilir olmadığından, deneyin sonuçlarına göre bireyler gün geçtikçe kobalta karşı dirençlerini kaybetmişlerdir. Sonuçlar tatmin edici olmadığından, stabilite düzeylerinin incelenmesi amacıyla koloniler 5 gün boyunca 4 mM CoCl2 içeren sıvı ortamda büyütülmüş, ardından 5 gün boyunca taze M27 sıvı besiyerine aktarılarak her günün sonunda katı LB besiyerine damlatma testi uygulanmıştır. İlk gün ve son günün katı besiyerlerine bakıldığında, artan kobalt konsantrasyonlarında bile ilk ve son gün üreyebilen kolonilerin dilüsyon dereceleri aynıdır. Damlatma tekniğinde alınan gözle görünen sonuçlar güvenilir olduğundan, bu test bitiminde kolonilerin kobalt stresine karşı geliştirdiği direncin kalıcı bir direnç olduğu sonucuna varılmıştır. Son olarak, referans suşun ve G7’nin 4 mM CoCl2 varlığında ve kobaltsız ortamlarda optik yoğunluklarının 535 nanometre dalga boyunda belli aralıklarla ölçümü ve hücre kuru ağırlıklarının tartımı sonucu büyüme eğrileri çizilerek birbiriyle karşılaştırılmıştır.Rhodobacter sphaeroides is a gram negative purple non-sulfur α- proteobacterium found in soil, mud, deep lakes and stagnate waters. It has metabolic diversity, as it is able to grow under photoheterotrophic, photoautotrophic, chemoheterotrophic and chemoautotrophic conditions. It can alter its metabolism according to the changing environmental conditions and nutrient deficiency. Due to its metabolic versality, sequenced genome and no requirement of unusual conditions for growth, it is commonly used in biotechnological applications. In response to harmful effects of plastic wastes on the environment, there has been great interest in the production and usage of biodegradable plastic materials. R. sphaeroides is capable of synthesizing and storing biodegradable and biocompatibile polyester polyhydroxybutyrate (PHB) as insoluble inclusion bodies in cytoplasm. Some of the other byproducts of R.sphaeroides in industry are 5-aminolevulinic acid, Coenzyme Q10, carotenoids, vitamin B12, indole terpenoids and plant hormones. Large scale H2 production in a photobioreactor, ZnS nanoparticle production for medical purposes and potential usage in bioremediation are also reasons for biotechnological importance of R. There are different response mechanisms of microorganisms to metal exposure, such as intracellular and extracellular sequestration, metal exclusion by permeability barrier, active transport of the metal and enzymatic detoxification. R. sphaeroides has the ability to survive under changing stress conditions by modifying its cellular and genetic composition. For instance, oxidative stress causes down-regulation of the carotenoid genes, while heavy metal stress increases membrane integrity. In another study, cobalt-resistant R. sphaeroides population was obtained under gradually increasing cobalt stress conditions, using evolutionary engineering approach. The last (64th) population was able to survive 15 mM cobalt stress, with a survival rate of 21%. The last population was spread onto solid Luria Broth plate and eight colonies (called G1-G8) were selected from there. In this study, the selected individual mutants were phenotypically characterized. At the beginning, screening test was performed by optical density measurements at 535 nm and viable cell counting method, to determine the stress resistance of the reference strain, then spot assay and Most Probable Number tests were done to determine cobalt resistance of the mutant colonies. After that, cross-resistance tests were performed to determine potential resistance of the colonies against different stress types. Various concentrations of nickel (ІІ) chloride (2mM, 2.2 mM, 2.4 mM), ethanol (8% v/v), sodium chloride (0.5 M), aluminum chloride (5 mM), copper (ІІ) chloride (0.5 mM), magnesium chloride (500 mM, 750 mM, 1M), hydrogen peroxide (1 mM, 2 mM), iron (ІІ) chloride (4 mM, 5 mM), manganese (ІІ) chloride (10 mM), boric acid (30 mM, 50 mM), caffeine (20 mM), ammonium iron(II) sulfate (5 mM), zinc chloride (1 mM) were used. As a result of the cross-resistance tests, the colonies G4, G6 and G7 were selected for further experiments. Besides, G7 showed significantly higher cross-resistance against nickel, boric acid, caffeine and magnesium stresses. The genetic stability analyses of those three mutant colonies were then carried out. The main aim of these tests was to measure the persistence of CoCl2 resistance of G4, G6 and G7 in the absence of CoCl2 stress, and to find out if their resistance is permanent or not. It was shown that the selected mutants had genetically stable cobalt resistance characteristics. Finally, growth curves of the reference R. sphaeroides strain and the selected G7 were obtained and compared to each other.Yüksek LisansM.Sc