Inverse Metabolic Engineering Of Aluminium-resistant Saccharomyces Cerevisiae

Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2015Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2015Aluminyum (Al+3) toksik olmasına rağmen suda, ilaçlarda, yiyecek ve içeceklerde aluminyum ile karşılaşılmaktadır. Aluminyumun organizmada organik moleküllerle etkileştiği ortaya konmasına rağmen toksisite veya tolerans mekanizması yeterince bilinmemektedir. Günlük hayatta birçok şekilde maruz kalınan aluminyum, kalp kapakçığında birikerek hastalık nedeni olabilmektedir. Bununla beraber, beyinde plak oluşturarak Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarla da ilişkili olduğu bilinmektedir. Buna karşın, böbrek hastalarına diyaliz ile birlikte tedavi amaçlı verilen ilaçlar gibi aluminyum içeren ilaçlar da mevcuttur. Bu durum birçok tartışmayı beraberinde getirmektedir. Saccharomyces cerevisiae moleküler biyolojide ve biyoteknolojik uygulamalarda uzun süredir kullanılan bir model organizmadır. Hızlı üremesi ve üreme koşullarının ekonomik olması başlıca tercih sebeplerindendir. Haploid ve diploid olarak bulunabilir ve insan gibi yüksek ökaryotlarla büyük oranda genom homolojisine sahiptir. Bu yönüyle S.cerevisiae insanla ilişkilendirilmiş hastalıklar üzerinde yapılan çalışmalarda kullanılmaktadır. Hastalık mekanizmalarının moleküler düzeyde incelenmesine ve metabolik yolakların anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. S.cerevisiae bilimsel araştırmaların yanı sıra, endüstride de büyük ölçüde tercih edilmektedir. Fermentasyon özelliği nedeniyle, fırıncılıkta ve alkollü içecek endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, S.cerevisiae mayası aluminyum tolerans mekanizmasının incelenmesine yönelik model organizma olarak kullanılmıştır. Bu amaçla tersine metabolik mühendislik yöntemi kullanılarak, S.cerevisiae giderek artan aluminyum stres düzeylerinde, ardarda yapılan kesikli kültürlerle üretilerek, aluminyuma yüksek direnç gösteren mutant maya suşları, seleksiyon yoluyla elde edilmiştir. Çalışmada S.cerevisiae CEN.PK 113-7D suşu kullanılmıştır. Bu suş kimyasal mutajen (EMS) kullanılarak rastgele mutasyona uğratılmıştır. Bu işlem sonucunda, yüksek genetik çeşitliliğe sahip bir populasyon elde edilmiştir. Kimyasal mutasyona uğratılmayan yaban tip suş 905 olarak adlandırılırken, mutasyona uğratılmış populasyon 906 olarak adlandırılmıştır. Çalışmaya başlamadan önce aluminyumun bu suşlar üzerindeki inhibisyon etkisinin belirlenmesi amacı ile aluminyum varlığında tarama testi yapılmıştır. Bunun için 905 ve 906 suşları, 0.05mM, 0.1mM, 0.4mM, 0.6mM, 1mM, 2mM, 5mM, 10mM, 25mM, 50mM AlCl3 varlığında inkübe edilmiştir. Bu deneyin sonuçlarına göre seleksiyon deneyleri için başlangıç konsantrasyonu 0.5 mM, adım büyüklüğü de 0.5 mM olarak belirlenmiştir. 906 populasyonu ilk olarak 0.5 mM AlCl3’e maruz bırakılmıştır. 24 saatlik inkübasyondan sonra hayatta kalan bireyler 1mM AlCl3’e maruz bırakılmıştır. Bu işlem, hayatta kalma oranı kritik seviyeye düşene kadar tekrar edilmiştir. Bu şekilde aluminyuma dirençli (0.5 mM-21.5 mM) 43 populasyon elde edilmiştir. 43. populasyonun 10-6’ya kadar dilüsyonu yapılmış ve katı YMM besiyerine ekilmiştir. 72 saat sonra oluşan kolonilerden 12 tanesi rastgele seçilmiştir. Seçilen kolonilerin aluminyum direnci açısından kıyaslanması ve daha yüksek direnç gösterenlerin seçilmesi amacı ile spot assay yöntemi uygulanmıştır. Bu yöntemde seçilen 12 birey, farklı konsantrasyonlarda aluminyum içeren katı besiyerine 10-8’e kadar seyreltilerek ekilmiştir. Spot assay sonucuna göre Alu9, Alu10, Alu11 ve Alu12 adlı mutant bireyler diğer 8 mutanta göre daha yüksek seviyede aluminyum direnci göstermiştir. Bu nedenle detaylı analizler için bu dört mutant seçilmiştir. Mutant bireylerin aluminyum direncinin nicel olarak belirlenmesi için En Muhtemel Sayı (MPN) yöntemi uygulanmıştır. Bu yöntemde seçilen 4 birey, 10 mM ve 15 mM AlCl3 varlığında 96-well plate içerisinde 5 tekrarlı olarak inkübe edilmiş ve koloni oluşumlarına göre direnç düzeyleri kıyaslanmıştır. MPN metodu ile istatistiksel olarak %95 güvenilirlikle direnç düzeyleri nicel olarak belirlenmiştir. MPN sonuçları göz önüne alınarak, bireylerin aluminyum direnci yaban tip suş olan 905 ile kıyaslanmış ve başarılı bir şekilde direnç kazandırıldığı anlaşılmıştır. Gözlenen direncin kalıcı bir mutasyon mu yoksa bir adaptasyon mu olduğunu belirlemek amacı ile genetik kararlılık testi uygulanmıştır. Bu testte seçilen 4 birey aluminyum içermeyen YMM besiyerinde büyütülmüştür. 24 saat inkübasyondan sonra aluminyum içermeyen taze besiyerine aktarılmış ve bu işlem 7 gün(7 pasaj) boyunca devam ettirilmiştir. Her gün alınan örneklerin aluminyum direnç seviyeleri MPN metodu uygulanarak incelenmiştir. Bireyler aluminyum içermeyen besiyerinde inkübe edildikten sonra aluminyum içeren besiyerine aktarılmış, hayatta kalma oranları belirlenmiş ve zamanla bu oranın düşmediği görülmüştür. Sonuç olarak; seçilen bireylerdeki direncin ortam adaptasyonu değil, genetik düzeyde kalıcı mutasyonlar olduğu anlaşılmıştır. Aluminyum direnci kazanan bireylerin farklı stres türlerine karşı direnç veya hassasiyet kazanıp kazanmadıklarını araştırmak amacı ile çapraz direnç testi uygulanmıştır. Bu testte Alu 9, Alu10, Alu11, Alu12, 905 (WT) ve 43. Nesil (LP) stres içeren katı besiyerine seyreltilerek ekilmiş ve 72 saat inkübe edilmiştir. Üreme durumlarına göre bireyler kıyaslanmıştır. Bu amaçla; hacmen %8 Etanol, 0.2 mM NiCl2, 0.7 mM H2O2, 0.25 mM CuSO4, 1 ml/L feniletanol, 1.3 M MgCl2, 2.5 mM CrCl3, 10 mM MnCl2, 30 mM FeSO4, 80 mM H3BO3, 300 mg/ml Propolis, 0.5 M CaCl2, 2 mM GaNO3, 75 µM AgNO3, 0.20 NiCl2, 10 mM NaCl, 3 mM ZnCl2, 1 mM CoCl2, 2 mM LiCl, pH 4, 25 mM FeCl2 denenmiştir. Ancak alüminyum direnci kazanan bireylerin, test edilen farklı streslere karşı önemli ölçüde direnç veya hassasiyet geliştirmedikleri gözlenmiştir. Yalnızca LiCl, GaNO3 ve etanole karşı hafif düzeyde çapraz direnç; AgNO3’e karşı ise hafif düzeyde hassasiyet gözlenmiştir. Spot assay, genetik kararlılık ve çapraz direnç sonuçları göz önüne alınarak, Alu10 mutantı detaylı moleküler ve fizyolojik analizler yapılmak üzere seçilmiştir. Sonuç olarak; yüksek konsantrasyonda AlCl3’a direnç gösterebilen bir S.cerevisiae suşu elde edilmiştir. Bu suşun alüminyum direncinin genetik açıdan kararlı olduğu da görülmüştür. Çapraz direnç testi uygulanarak alüminyum ile birlikte farklı streslere karşı hassasiyet veya direnç geliştirip geliştirmediği analiz edilmiş ve bazı stress türleri için hafif düzeyde direnç/hassasiyet gözlenmiştir. Daha sonra yapılacak çalışmada, elde edilen bu dirençli suşun transkriptomik ve/veya genomik analizi yapılacaktır. Bu sayede alüminyuma direnç sağlayan moleküler mekanizma anlaşılmaya çalışılacaktır. Alüminyuma dirençli mutantın alüminyum iyonlarını tutma kapasitesi de belirlenerek biyoremediasyon veya diğer endüstriyel uygulamalarda kullanılma potansiyeli de belirlenecektir. Ayrıca elde edilen alüminyuma dirençli S. cerevisiae, ökaryotik bir model organizma olarak alüminyum ile ilişkilendirilen nörodejeneratif hastalıkların mekanizmalarının aydınlatılmasına da katkıda bulunabilecektir.Although Al3+ is non-essential and toxic to life, it is commonly encountered in water, foods, medicines and beverages. Al3+ has been reported to interact with organic molecules in vitro, however, molecular mechanisms of aluminium toxicity/tolerance are not well-known. Aluminium is also related with human neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a model organism which has been used widely in molecular biology and biotechnology for a long time. In addition to research, it has also been used for many industrial applications. It can make fermentation which is very important in baking and wine industry. S.cerevisiae can be in haploid and diploid form and its genome has a high degree of homology with those of higher eukaryotes. This makes it important in understanding molecular mechanisms of human-related diseases. In this study, S. cerevisiae was used as a eukaryotic model organism to investigate aluminium tolerance mechanisms. An evolutionary engineering strategy based on batch selection at increasing Al3+ concentrations was employed to obtain aluminium-resistant S. cerevisiae mutants: initially, S. cerevisiae CEN.PK 113-7D wild type strain was chemically mutagenized to increase the genetic diversity of the initial population for selection. 905 (Wild Type) and 906 (EMS mutagenized wild type) were screened under different aluminium levels such as; 0.05, 0.1, 0.4, 0.6, 1, 2, 5, 10, 25, 50 mM to determine the initial aluminium stress level to be used during increasing stress level selections. A batch selection strategy was then applied to obtain aluminium-resistant S. cerevisiae mutants by gradually increasing aluminium-stress levels from 0.5 to 21.5 mM AlCl3 through 43 passages. The 43th last population was spread on plates and 12 individual mutants were randomly chosen. They were tested for their aluminium resistance by using spot assay procedure. According to spot assay results, 4 highly resistant mutants (named as Alu9, Alu10, Alu11, Alu12) were chosen for further analysis. In order to quantify the aluminium resistances of the mutants in detail Most Probable Number method was applied to those 4 mutant individuals. They were then tested for the genetic stability of the Al-resistance.Results showed that the mutants are genetically stable. Cross-resistance tests were also applied using a variety of other metal and non-metal stress types to test if the aluminium-resistant mutants developed cross-resistance or sensitivities to other stress types. For this purpose, the following stresses were tested: 8%(v/v) Ethanol, 0.2 mM NiCl2, 0.7 mM H2O2 , 0.25 mM CuSO4, 1 ml/L phenyl ethanol, 1.3 M MgCl2, 2.5 mM CrCl3, 10 mM MnCl2, 30 mM FeSO4, 80 mM H3BO3, 300 mg/ml Propolis, 0.5 M CaCl2, 2 mM GaNO3, 75 µM AgNO3, 0.20 NiCl2, 10 mM NaCl, 3 mM ZnCl2, 1 mM CoCl2, 2 mM LiCl, pH 4, 25 mM FeCl2. However, no significant cross-resistance or sensitivities to other stress types were detected, except for a slight level of LiCl,GaNO3 and ethanol tolerance, and a slight sensitivity to AgNO3. According to the experimental results, the best individual mutant (Alu10) was chosen for further detailed analyses at physiological and molecular levels.Yüksek LisansM.Sc