Evolutionary history and biogeography of the genus Scrophularia (Scrophulariaceae) and hemiparasitic Orobanchaceae (tribe Rhinantheae) with emphasis on reticulate evolution

This dissertation presents the results of my doctoral studies, which were focussed on main phylogenetic relationships and important evolutionary processes within two families of Lamiales, Scrophulariaceae Juss. (dealing with the type genus Scrophularia L.) and Orobanchaceae Vent. (tribe Rhinantheae Lam. & DC.). Rhinantheae are hemiparasitic plants with a predominantly Northern Hemisphere distribution, alongside some representatives which have radiated on southern continents, e.g. the genus Bartsia L. sensu Molau (1990) with several Andean and two afromontane species. The figwort genus Scrophularia is widespread across the temperate Northern Hemisphere. It comprises about 250 species of mainly herbaceous or suffrutescent perennials, and is characterized by considerable morphological variability and chromosomal diversity. Reticulate evolution is common in Scrophularia as well as several genera within Rhinantheae. The aim of this thesis was 1) to test previous phylogenetic hypotheses of Rhinantheae, also by including several small genera; 2) to investigate phylogenetic relationships within Bartsia sensu Molau (1990) and Odontites Ludw., and to re-evaluate existing taxonomic concepts; 3) to verify the monophyly of Scrophularia and, for the first time, establish a comprehensive phylogenetic framework including all relevant lineages; 4) to reconstruct the biogeographic history of the genus, to gain insight into colonization pathways and the processes which have formed present distribution patterns; 5) to determine possible causes for the high species diversity and endemicity in several areas of the distribution range; 6) to assess the influence of hybridization on the evolutionary history of Scrophularia, and to identify possible parental lineages of polyploid (and homoploid) hybrid species; 7) to examine the impact of hybridization and other processes on molecular phylogenetic reconstruction; and 8) to explore how the problems resulting from this influence can be alleviated or even utilized to elucidate the underlying processes; and to compile corresponding practical workflows. To achieve these goals, I followed a molecular systematic approach. Nucleotide sequences from five non-coding chloroplast loci (intergenic spacers trnQ-rps16 and psbA-trnH, the trnL-trnF region, part of the trnK region, and the rps16 intron) as well as nuclear ribosomal DNA (the internal transcribed spacer region, ITS) were analyzed to infer phylogenetic relationships. This was done using Bayesian inference, Maximum Likelihood and Maximum Parsimony approaches, and statistical parsimony networking. Information from nuclear intra-individual sequence polymorphisms as well as plastid indels was coded, and selected individuals were cloned for the ITS marker. Regarding plastid and nuclear data, among-dataset incongruence and within-dataset uncertainty and conflict were assessed with statistical tests and examined using unrooted phylogenetic networks (split networks). The biogeographic history of the genus was inferred using divergence time estimation and ancestral area reconstruction. Where appropriate, a taxon duplication approach was applied to permit the incorporation of incongruent taxa into a combined analysis of markers from both compartments. Plant material for the studies was obtained from specimens on loan from several herbaria and collected during herbarium studies at Vienna (W/WU) and Harvard University (A/GH); several species were cultivated at the greenhouses at the Botanical Garden in Munich. According to my phylogenetic analyses, Rhinantheae contain a core group of four major lineages. Bartsia sensu Molau (1990) is polyphyletic; most species belong to either the African genus Hedbergia Molau or the hitherto monotypic Bellardia All., with the latter also including Parentucellia Viv. For Odontites, a broader circumscription was proposed; Rhinantheae are updated to comprise app. 13 genera. Topological incongruence among plastid and nuclear trees in some cases could be the result of intergeneric hybridization; this process might also have created the genera Nothobartsia Bolliger & Molau and Odontitella Rothm. However, plastid and nuclear markers can be reconciled by pruning conflicting taxa. By contrast, my studies on Scrophularia revealed far more substantial plastid - nuclear marker incongruence. In ITS, intra-individual nucleotide polymorphism is widespread, which argues for incomplete concerted evolution and causes topological ambiguity. I inferred these phenomena to be caused by a combination of reticulation (including introgression), incomplete lineage sorting ("ILS") of ancestral polymorphisms, and, regarding ITS, possibly incipient pseudogenization and inter-array heterogeneity. Species diversity in Scrophularia is however largely attributable to ancient and recent hybridization and (allo-)polyploidization, for which I was able to illustrate several examples. It is evident that these processes were one major driving force in the evolutionary history of the genus. The other key factor likely was allopatric speciation, promoted by the heterogeneous topography of the preferred mountain habitats. Often, these two factors have supposedly acted in combination, also under the influence of different climatic periods and associated temperature oscillations (including the Pleistocene glaciations). The emergence and diversification of Scrophularia are closely linked to geological and climatic events in the Irano - Turanian region and Central / Eastern Asia; the genus originated in Southwestern Asia during the Miocene. Most diversification events and further successful dispersals to its present distribution areas occurred in the Pliocene and Pleistocene. This also involved the colonization of the New World across the Bering Land Bridge and dispersal to the Macaronesian and Caribbean islands. My analyses support two main species groups in Scrophularia, which correspond to previously proposed major sections. The genus is monophyletic upon inclusion of the Himalayan genus Oreosolen Hook.f. Like in Rhinantheae, morphological synapomorphies are rarely present, and some morphological traits have presumably evolved in convergence. Scrophularia represents a useful model for studying evolutionary history in the context of reticulation. This dissertation provides the first comprehensive phylogenetic framework for the genus, which will serve as a solid basis for subsequent research. The methodical workflows implemented in this thesis constitute valuable guidelines for researchers dealing with similarly complex plant lineages.Die vorliegende Dissertation stellt die Ergebnisse meiner Doktorarbeit vor, die die grundsätzlichen phylogenetischen Beziehungen und wichtige evolutionäre Prozesse innerhalb zweier Familien der Lamiales zum Schwerpunkt hatte, den Scrophulariaceae Juss. (und hierbei die Typusgattung Scrophularia L.) und den Orobanchaceae Vent. (Tribus Rhinantheae Lam. & DC.). Die Rhinantheen sind halbparasitische Pflanzen mit einer vornehmlich nordhemisphärischen Verbreitung, abgesehen von einigen Vertretern mit Radiationen auf südlichen Kontinenten, wie z.B. der Gattung Bartsia L. sensu Molau (1990) mit mehreren andinen sowie zwei afromontanen Arten. Die Gattung Scrophularia, die Braunwurz, ist weitverbreitet auf der gemäßigten Nordhalbkugel. Sie umfaßt ca. 250 hauptsächlich krautige oder halbstrauchige, mehrjährige Arten, und ist durch erhebliche morphologische Variabilität sowie eine Vielfalt an Chromosomenzahlen gekennzeichnet. Vernetzte Evolution ("reticulate evolution") ist häufig, wie auch in einigen Gattungen der Rhinantheae. Das Ziel dieser Doktorarbeit war 1) bestehende stammesgeschichtliche Hypothesen betreffend die Rhinantheae zu überprüfen, auch unter Einbeziehung mehrerer kleiner Gattungen; 2) phylogenetische Beziehungen innerhalb Bartsia sensu Molau (1990) und Odontites Ludw. zu erforschen, und bestehende taxonomische Konzepte neu zu bewerten; 3) die Monophylie von Scrophularia zu bestätigen und erstmalig ein umfassendes verwandtschaftliches Grundgerüst zu etablieren, das alle relevanten Linien umfaßt; 4) die biogeographische Entwicklung der Gattung zu rekonstruieren, um Einblicke in Ausbreitungswege zu erhalten sowie in die Prozesse, welche gegenwärtige Verbreitungsmuster geformt haben; 5) mögliche Gründe für die hohe Artdiversität und den Endemismus in mehreren Bereichen des Verbreitungsgebiets zu finden; 6) den Einfluß von Hybridisierung auf die Evolutionsgeschichte von Scrophularia einzuschätzen, und mögliche Elternlinien polyploider (und homoploider) hybridogener Arten zu identifizieren; 7) die Einwirkung von Hybridisierung und anderen Prozessen auf die molekularbasierte Rekonstruktion von Stammesgeschichte zu untersuchen; und 8) zu erkunden wie die Probleme, die sich aus diesem Einfluß ergeben, abgeschwächt oder sogar nutzbar gemacht werden können, um die zugrundeliegenden Prozesse aufzuklären; und entsprechende praktische Arbeitsabläufe zusammenzustellen. Um diese Ziele zu erreichen, verfolgte ich einen molekularsystematischen Ansatz. Nukleotidsequenzen von fünf nicht-codierenden Chloroplasten-Loci (intergenic spacer trnQ-rps16 und psbA-trnH, die trnL-trnF Region, ein Teil der trnK Region, und das rps16 Intron), sowie ribosomale Kern-DNA (die internal transcribed spacer Region, ITS), wurden analysiert, um auf Verwandtschaftsbeziehungen rückzuschließen. Dabei wurden Bayes'sche Statistik, Maximum-Likelihood- und Maximum-Parsimony-Methoden, und Netzwerke auf Basis statistischer Parsimonie verwendet. Information aus nukleären intraindividuellen Sequenzpolymorphismen und plastidären Insertionen-Deletionen (Indels) wurde codiert, und ITS-Sequenzbereiche ausgewählter Individuen wurden kloniert. Inkongruenzen zwischen den Plastiden- und Kerndatensätzen sowie Konflikt und Unklarheit innerhalb derselben wurden mittels statistischer Tests bewertet, und unter Verwendung von nicht-gewurzelten phylogenetischen Netzwerken (Split- Netzwerken) untersucht. Aus der Datierung von Artaufspaltungen (divergence time estimation) sowie der Rekonstruktion ursprünglicher Verbreitungsgebiete (ancestral area reconstruction) wurde die historische Biogeographie der Gattung abgeleitet. Wo nötig wurde eine Methode zur Aufteilung der Sequenzinformation einzelner Akzessionen (taxon duplication approach) angewandt, um inkongruente Taxa in eine kombinierte Analyse von Markern beider Kompartimente einbeziehen zu können. Pflanzenmaterial für die Studien wurde von entliehenen Belegen diverser Herbarien entnommen, auch wurden Herbarstudien in Wien (W/WU) und an der Universität Harvard (A/GH) durchgeführt; mehrere Arten wurden in den Gewächshäusern des Botanischen Gartens München kultiviert. Meine Abstammungsanalysen zeigen, daß die Tribus Rhinantheae eine zentrale Artengruppe aufweist, die aus vier Hauptlinien besteht. Bartsia sensu Molau (1990) ist polyphyletisch; die meisten Arten gehören entweder der afrikanischen Gattung Hedbergia Molau an oder der bis dato monotypischen Bellardia All.; letztere beinhaltet auch Parentucellia Viv. Eine breitere Umschreibung wurde für Odontites vorgeschlagen; die Tribus Rhinantheae besteht nun aus ca. 13 Gattungen. Inkongruenzen bezüglich der Position von Taxa in Plastiden- versus Kernmarker-Stammbäumen könnten in einigen Fällen das Ergebnis gattungsübergreifender Hybridisierung sein; dieser Prozess könnte auch die beiden Gattungen Nothobartsia Bolliger & Molau und Odontitella Rothm. erzeugt haben. Nach Ausschluß zwiespältiger Akzessionen können plastidäre und nukleäre Marker jedoch kombiniert analysiert werden. Im Gegensatz dazu offenbarten meine Studien an Scrophularia weit beträchtlichere Konflikte zwischen Chloroplasten- und Kernmarkerdaten. Zusätzlich sind innerhalb der ITS-Sequenzen häufig Nukleotid-Polymorphismen vorhanden, was zu Unsicherheiten in der Baumtopologie führt und für eine unvollständige Homogenisierung verschiedener Sequenzkopien spricht (incomplete concerted evolution). Diese Phänomene sind nach meinen Schlußfolgerungen das Ergebnis einer Kombination von retikulater Evolution (inklusive Introgression), unvollständiger Aufteilung ursprünglicher Allelvarianten (incomplete lineage sorting, "ILS"), und, im Fall von ITS, möglicherweise beginnender Pseudogenisierung und abweichender Kopien in getrennten Genbereichen. Die Artenvielfalt in Scrophularia ist jedoch zum großen Teil auf historische und rezente Hybridisierung und (Allo-)Polyploidisierung zurückzuführen, für die ich mehrere Beispiele aufzeigen konnte. Es ist offensichtlich, daß diese Prozesse eine der Hauptantriebskräfte in der Evolutionsgeschichte der Gattung waren. Der andere Schlüsselfaktor war wahrscheinlich geographische Artbildung, gefördert durch die ungleichmäßige Topographie der bevorzugten bergigen Habitate. Diese beiden Faktoren wirkten vermutlich des Öfteren kombiniert, auch unter dem Einfluß verschiedener Klimaperioden und der dazugehörigen Temperaturschwankungen (inklusive der Vergletscherungen während des Quartärs). Das Erscheinen und die Auffächerung von Scrophularia sind eng mit geologischen und klimatischen Ereignissen in der irano-turanischen Florenregion sowie in Zentral- und Ostasien verbunden; die Gattung entstand in Südwestasien, während des Miozän. Die meisten Artaufspaltungsereignisse und die weitere erfolgreiche Ausbreitung in ihre heutigen Verbreitungsgebiete fanden im Pliozän und Pleistozän statt. Dies beinhaltete auch die Kolonisierung der Neuen Welt über die Bering-Landbrücke und die Ausbreitung auf die makaronesischen und karibischen Inseln. Meine Untersuchungen stützen zwei große Artgruppen in Scrophularia, die bisher vorgeschlagenen Hauptsektionen entsprechen. Die Gattung ist monophyletisch nach Einbeziehung der himalayischen Gattung Oreosolen Hook.f. Wie in den Rhinantheen sind kaum gemeinsame abgeleitete morphologische Merkmale (Synapomorphien) vorhanden, und einige morphologische Eigenschaften haben sich vermutlich konvergent entwickelt. Scrophularia stellt ein geeignetes Modell dar, um Evolutionsgeschichte unter dem Einfluß von Retikulation zu erforschen. Diese Dissertation legt das erste umfassende Grundgerüst der Stammesgeschichte der Gattung vor, das als solide Basis für weitergehende Forschungen dienen wird. Die methodischen Arbeitsschritte, die in dieser Arbeit angewandt wurden, bilden wertvolle Richtlinien für Forscher, die mit ähnlich komplexen Pflanzengruppen arbeiten