Bacterial ghosts as carriers of ice nucleation proteins

Bacterial Ghosts (BGs) sind definiert als leere Zellhüllen, welche von Gram-negativen Bakterien abstammen und durch kontrollierte Expression des klonierten Gens E vom Bakteriophagen ΦX174 erzeugt werden. BGs spiegeln die vollständige Zellschichtzusammensetzung des Vorgänger-Bakteriums zum Zeitpunkt ihrer Herstellung wider. Folglich bestehen BGs aus den drei verschiedenen Gram-negativen Zellschichten, der cytoplasmatischen Membran, dem Peptidoglycan im periplasmatischen Raum und der bakteriellen äußeren Membran. Das Hauptziel dieser Arbeit war, das bakterielle Eisnukleationsprotein (INP) InaZ von Pseudomonas syringae an der Oberfläche der äußeren Membran von E. coli BGs zu verankern, sowie an deren inner Membran, dem internen Lumen der BGs zugewandt. Durch Tröpfchen-Gefrier-Versuche wurde die Fähigkeit der unterschiedlich konstruierten INP-BGs als Eiskeime zu wirken und somit die heterogene Eisbildung von unterkühltem Wasser zu katalysieren, untersucht, um deren Effizienz Wassermoleküle in einer eisartigen Struktur anzuordnen, bewerten und vergleichen zu können. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die BG Produktion des Tierpathogenen Bakteriums Bordetella bronchiseptica sowie die Inaktivierung von E-Lyse überlebenden Mutanten durch Ethyleneimin (EI). Die inaktivierten BGs wurden als Impfstoffkandidat an Zwingerhusten leidenden Hunden getestet. Darüber hinaus wurde die Eisnukleationsaktivität von EI und β-Propriolacton (BPL) inaktivierten INP-BGs verglichen.Bacterial ghosts (BGs) are defined as empty cell envelops derived from Gram-negative bacteria produced by controlled expression of the cloned gene E of bacteriophage ΦX174. BGs represent the bacterial cell-envelope composition at the time point of their production. BGs are composed of the three distinct Gram-negative cell-layers, cytoplasmic membrane, peptidoglycan within the periplasmic space and the bacterial outer-membrane The aim of this thesis was to insert the bacterial ice nucleation protein (INP) InaZ of Pseudomonas syringae on the surface of the outer-membrane of E. coli BGs and to expose it on the inner-membrane facing the internal lumen of the BGs. The ability of different constructed INP-BGs to act as ice nuclei catalyzing heterogeneous ice formation of supercooled ultra-pure water had to be investigated by droplet-freezing assay to evaluate and compare the efficiency of orienting water molecules into an ice-like structure. Another aim of this thesis was to produce for the first time BGs from the animal pathogen Bordetella bronchiseptica and inactivate E-lysis escape mutants with ethyleneimine (EI). The EI inactivated BGs were used as vaccine candidate for kennel cough in dogs and were immunogenetically compared to a commercial vaccine also inactivated with EI. The structural functionality of ice nucleation of INP E. coli BGs after EI or β-propriolactone (BPL) inactivation had to be compared