Cell-based screening system for ecdysone receptor activation and rational iseticide design with association of computational approaches

Applied cellular biotechnology is essential for Integrated Pest Management, because through several high performance techniques, it allows the rational planning of new insecticides. Nuclear receptors are important targets in the research for new insecticides, and the ecdysteroid receptor is one of the most important targets nowadays. This receptor is a protein whose artificial transactivation is mediated by molecules (ligands) that bind to its active site, thus causing an agonist or antagonistic effect on the hormone 20-hydroxyecdysone. Computational tools are of fundamental importance for the understanding of receptor/ligand interactions, thus enabling the design of new molecules. The aim of this research was to establish a protocol for transfection of insect cells with a plasmid sensitive to the activity of the ecdysone receptor, to compare the activity of ecdysteroids and dibenzoylhydrazines, and new organocalcogenic molecules (similar to dibenzoylhidrizines) understanding its mechanism of action with computational tools. Bioassays consisted of the transfection of S2 (Diptera) and SF9 (Lepidoptera) cell lines with the plasmid B.act.ere.luc., designed to express the luciferase enzyme against the activation of the receptor. The activity of the hormones 20-hydroxyecdysone and Ponasterone-A, the insecticide tebufenozide (dibenzoylhydrazine) and eleven new molecules of dibenzoylhydrazines in cell lines were evaluated. Dose response curves were prepared with the two hormones and tebufenozide. With the new molecules, the cytotoxicity, agonist and antagonist effect on ecdysteroids was investigated. To investigate the antagonistic activity of the new molecules on the ecdysteroids, the parameter established for a molecule have a considerable effect was the reduction of >50% of the activity, comparing to the action of the isolated hormone. Finally, using three-dimensional models, the interactions between ligands and the active site of the Diptera and Lepidoptera ecdysone receptor were investigated. It was concluded that it is possible to find new molecules with activity in the insect ecdysone receptor. In both cell lines, Ponasterone-A was the most active molecule, and in SF9, tebufenozide was more active than 20-Hydroxyecdysone. Among the new dibenzoylhydrazines tested, none showed an agonist effect. Antagonistic effect was observed only in Lepidoptera cells, but with different patterns according to the hormone used. The antagonistic activity observed from some new molecules can be due to the fitting of them in the binding site from the ecdysone rceptor, blocking important ligation among receptor and hormone.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESA biotecnologia celular aplicada é essencial para o Manejo Integrado de Pragas, através da aplicação de várias técnicas de alto desempenho, possibilita o planejamento racional de novos inseticidas. Os receptores nucleares são importantes alvos na busca de novos inseticidas, destacando-se o receptor de ecdisteroides como um dos alvos mais importantes atualmente. Este receptor é uma proteína cuja ativação artificial é mediada por moléculas (ligantes) que se ligam ao seu sítio ativo, causando assim um efeito agonista ou antagonista ao hormônio natural, o 20-Hidroxiecdisônio. Ferramentas computacionais são de fundamental importância para o entendimento da interação receptor/ligante, possibilitando assim, o design de novas moléculas. Com isto, esta pesquisa teve como objetivo estabelecer um protocolo para transfecção de células de insetos com um plasmídeo sensível à atividade de receptor de ecdisteroides, comparar a atividade de ecdisteroides e dibenzoilhidrazinas, e novos compostos organocalcogênicos (estruturalmente semelhantes a dibenzoilhidrazinas), entendendo seu mecanismo de ação com o uso de ferramentas computacionais. Os bioensaios consistiram na transfecção de células das linhagens S2 (Diptera) e SF9 (Lepidoptera) com o plasmídeo B.act.ere.luc., planejado para expressar a enzima luciferase frente à ativação do receptor de ecdisteroides das células. Foram avaliadas a atividade dos hormônios 20-hidroxiecdisônio e PonasteronaA, do inseticida comercial tebufenozide (dibenzoilhidrazina) e de onze novas moléculas organocalcogênicas, em linhagens celulares. Foram preparadas curvas de dose resposta com os dois hormônios e a tebufenozida. Com as novas moléculas, foi investigada a citotoxicidade, efeito agonista e antagonista. Para a atividade antagonista, o parâmetro estabelecido para uma molécula possuir considerável efeito foi a redução de >50% da atividade, comparando à ação do hormônio isolado. Posteriormente foram usados modelos tridimensionais para investigar as interações entre os ligantes e o sitio ativo do receptor de ecdisteroides das ordens Diptera e Lepidoptera. Concluiu-se que é possível utilizar o presente sistema de triagem em células, na busca de novas moléculas com atividade no receptor de ecdisteroides. Em ambas as linhagens celulares, Ponasterona-A foi a molécula mais ativa, sendo que na linhagem SF9, a tebufenozida se mostrou mais ativa quando comparada a 20-Hidroxiecdisônio. Das novas moléculas testadas, nenhuma apresentou efeito agonista, entretanto, efeito antagonista foi observado apenas em células de Lepidoptera, com padrões diferentes conforme o hormônio utilizado. As interações observadas entre o receptor e as moléculas antagonistas servirão como base para o design racional de novas moléculas inseticidas