Dose dependent effect of C-Type Natriuretic Peptide during TGF-ß1 induced chondrogenic differentiation of trabecular bone-derived adult human mesenchymal stem cells

Kök hücreler embriyonik dönemden başlayarak fötal ve doğum sonrası yaşamda doku ve organların gelişimleri ve idamelerinde önemli rol oynarlar. Bu çalışmada trabeküler kemik kökenli insan mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) pratik bir hücre kültürü yöntemi ile izolasyonu, bu hücrelerin karakterizasyonları ve değişim potansiyellerinin gösterilmesi ve bunu takiben bu MKH’lerin transforme edici büyüme faktörü (TGF)-β1 ile uyarılmış kondrojenik değişimi sürecinde, C-tipi natriüretik peptid (CNP) sinyal yolunun kondrogenez üzerindeki doza bağımlı etkisinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Ortopedik artık cerrahi materyalden alınan 1-2 cm3’lük trabeküler kemik örnekleri steril şartlarda, %10 FBS, 50mg/ml penisilin-streptomisin içeren DMEM (yüksek glukoz, L-glutamin pozitif) içerisinde laboratuvara taşınmıştır. Steril şartlarda aynı besi yeri içerisinde parçalara ayrılan materyal 4-5 kez temiz besi yeri ile yıkanmıştır. Bu kemik fragmentleri, yüzeylerinde bulunan hücresel materyalden arındırılmak için 2mM L-glutamin, 50mg/ml askorbik asit, 256U/ml kollajenaz ve 50mg/ml penisilin-streptomisin içeren DMEM içerisine aktarılarak, 37Co’de, %5 CO2’li ve nemli inkübatörde 3-4 saat bekletilmiştir. Takiben steril izotonik solüsyon ile 4-5 kez yıkanmıştır. Temiz besi yerine alınan kemik fragmentleri kültür kaplarına aktarılmış ve 37Co’de, %5 CO2’li ve nemli inkübatöre yerleştirilmiştir. Hücrelerin trabeküler kemik fragmentlerinden migrasyonları ve çoğalmaları süreci takip edilmiş, 3-4 günde bir besi yeri tazesi ile değiştirilmiştir. %60-70 doygunluğa ulaşan kültürler pasajlanarak 3. pasaj (P3) hücreler elde edilmiştir. Bu hücrelerde MKH’lere özgü hücre yüzey belirleyicilerinin immunfluoresan analizi ve hücrelerin uygun mikro çevre koşulları altında osteojenik, kondrojenik ve adipojenik değişimleri uyarılmıştır.MKH’lerin in vitro kondrojenik değişimleri, çökelti kültürlerinde, TGF-β1’in (10 ng/ml) uyarıcı etkisi altında gerçekleştirilmiştir. Bu süreçte farklı dozlarda (10-8M, 10-7M, 10-6M) CNP uygulanarak, kondrojenik matriks içeriğindeki glikozaminoglikan sentez değişiklikleri Alcian mavisi boyaması ile incelenmiştir. Hücrelerin kemik fragmentlerinden ilk migrasyonları 7-11. günlerde, hücrelerin kemik fragmentleri çevresinde doygun bir düzeye ulaşmaları 11-20. günlerde ve hücrelerin tüm kültür ortamında, odaklar arası bölgelerde de doygun seviyeye ulaşmaları 14-26. günlerde gözlenmiştir. P3 hücrelerin immunfluoresan analizi sonucunda STRO-1, CD73 ve CD105 için (+); CD34, CD45 ve CD144 için (-) oldukları gösterilmiştir. Bu MKH’lerin uygun mikro çevre koşullarında osteojenik, kondrojenik ve adipojenik değişimleri ve bu dokulara özgü molekülleri mRNA düzeyinde ifade ettikleri gösterilmiştir. TGF-b1 ile uyarılmış kondrojenik değişim sürecinde elde edilen kondrojenik dokularda 10-8M ve 10-7M CNP’nin Alcian mavisi boyanma koyuluğunu doza bağımlı olarak arttırdığı, 10-6M CNP’nin ise kontrol grubu ile karşılaştırıldığında boyanma koyuluğunu azalttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada trabeküler kemik fragmentlerinden MKH’lerin izolasyonlarında kullanılabilecek pratik bir hücre kültürü yönteminin uygulanması ve elde edilen hücrelerin kondrojenik değişimlerinin gösterilmesinin yanı sıra bu süreçte etkin olan CNP sinyal yolunun doza bağımlı etkisi ortaya konmuştur.Starting from the embryonic stages, stem cells play important roles in tissue and organ development during the fetal period and also their maintenance after birth. The aim of this study was to isolate trabecular bone-derived human mesencymal stem cells (MSCs) via a simple cell culture technique, followed by their characterization, and demonstration of their differentiation potential and finally to investigate the dose dependent effect of CNP signaling in TGF-β1 induced chondrogenic differentiation of MSCs. Trabecular bone fragments of 1-2 cm3 obtained from wasted surgical material were taken into DMEM (high glucose, L-glutamine positive) supplemented with antibiotics (50μg/ml penicillin-streptomycin) and %10 FBS. Bone fragments were minced and washed for 4-5 times. They were transferred to a flask containing 2mM Lglutamine, 50mg/ml ascorbate, 256U/ml collagenase and 50mg/ml penicillinstreptomycin, placed in a humidified incubator at 37°C and %5 CO2 until the cellular material on the bone surface disappeared (3-4 h). Afterwards fragments were washed with isotonic solution for 4-5 times, plated in culture containers and placed in a humidified incubator at 37°C and %5 CO2. Migration and outgrowth of MSCs from trabecular bone fragments were followed. Medium was changed every 3-4 days. When cultures reached %60-70 confluencey, cells were passaged. Immunofluorescence analysis of specific cell surface markers was performed on third passage (P3) cells. Differentiation of these MSCs to osteocytes, chondrocytes and adipocytes in cell culture were demonstrated. In vitro chondrogenic differentiation of MSCs was performed under the induction of TGF-β1 (10 ng/ml) in pellet culture. Changes in glycosaminoglycan synthesis within the chondrogenic matrix of pellets after treatment with different doses (10-8M, 10-7M, 10-6M) of CNP was analyzed on the basis of Alcian blue staining. Results revealed that first cells appeared migrating out from the bone fragments after 7-11 days. Cells proliferated and became confluent in close proximity of bone fragments after 11-20 days. Cells became confluent throughout the culture after 14-26 days. Immunofluorescence analysis of P3 MSCs revealed positive staining for STRO-1, CD73 and CD105 and negative staining for CD34, CD45 and CD144. Differentiation of these MSCs into osteocytes, chondrocytes and adipocytes were demonstrated and expressions of tissue specific molecules at mRNA level were shown. Cultures induced with TGF-b1 and treated with different doses of CNP showed that CNP supplementation at 10-8M and 10-7M concentrations increased Alcian blue staining intensity in a dose dependant manner, whereas at 10-6M concentration suppressed it. In conclusion, this study demonstrated the isolation of human trabecular bonederived MSCs utilizing a simple cell culture technique, and also their characterization and differentiation potential. CNP effects on glycosaminoglycan synthesis during early chondrogenic differentiation were dose depended, and 10-7M CNP concentration was the most effective dose