Cytométrie diélectrophorétique pour les mesures des signatures diélectriques de cellules vivantes au niveau d’une population

Flow cytometry in combination with staining and antibody labelling presents one of the most valuable tools in current biotechnology providing information about cell population heterogeneity, cell size and volume, as well as expression of certain surface and intracellular molecules. The increased cost and the fundamental difficulty of these methods, however, are attributed to the requirement of the surface marker molecules. Attractive alternatives to flow cytometry are label-free methods, such as micro-filtration, dielectric spectroscopy, and electro-kinetic methods. Out of these methods, dielectrophoresis (DEP) was selected as the most promising approach. This thesis focuses on improvements of current DEP-based technologies, and development and establishment of a new method to address the issues of dielectrophoretic (DEP) cytometry enabling label-free non-invasive probabilistic measurement of cell dielectric (DE) signatures on population level, as well as enabling identification of reliable biomarkers for cell changes.First, improvements of DEP cytometry based on DEP-induced lateral cell translation through fabrication are explored. A benchmark microfluidic live cell sorting system is presented, and the effect of microchannel misalignment above electrode topologies on live cell DEP is discussed in detail. Simplified model of budding S. cerevisiae cell is presented and validated experimentally in fabricated microfluidic devices. A novel fabrication process enabling rapid prototyping of microfluidic devices with well-aligned integrated electrodes is presented and the process flow is described. Identical devices were produced with standard PDMS soft lithography processes. The presented fabrication process significantly improved the alignment of the microstructures. According to the benchmark study, the standard PDMS procedure fell well outside the range required for reasonable cell sorting efficiency. The fabrication time and costs of the proposed methodology were found to be roughly the same.Second, a method called distributed dielectrophoretic cytometry (2DEP cytometry) was developed. It uses a DEP-induced vertical translation of live cells in conjunction with PIV in order to measure probabilistic distribution of live cell DE signatures on an entire cell population. The method was integrated in a microfluidic device with integrated electrodes. Cells passing through the microchannel are acted on by sedimentation forces, while DEP forces either oppose sedimentation, support sedimentation, or neither, depending on the DE signatures of the cells. The heights at which cells stabilize correspond to their DE signature and are measured indirectly using particle image velocimetry (PIV).Experimental data quantify the DE signature of a S. cerevisiae population and Human immortalised myelogenous leukaemia cell line K562. First, the effect of over-expression of certain membrane protein was studied in S. cerevisiae cells. Measured distribution of DEP forces was compared to cell population expressing a cytoplasmic protein at the same rate. Second, 2DEP cytometry was applied to K562 cell line. Effects of stress response triggered by various inducers on the DE signature of the cell population were analysed.Finally, statistical data analysis defined adjusted kernel density estimation to overcome the finite nature of the measured data. In combination with Wasserstein pseudometrics from sampled data, the Wasserstein distance spectra, denoted as Wasserstein signatures, were quantified and linked to certain cell changes. These signatures may be used as reliable biomarkers for cell changes.In conclusion, 2DEP cytometry showed it is sensitive enough to identify certain changes in cell states. The novel 2DEP cytometry device is therefore a promising alternative to conventional flow cytometryLa cytométrie en flux en association avec la coloration et le marquage d'anticorps présente l'un des outils les plus précieux en biotechnologie actuelle fournissant des informations sur l'hétérogénéité des populations cellulaires, la taille et le volume des cellules, ainsi que l'expression de certaines molécules de surface et intracellulaires. L'augmentation du coût et la difficulté fondamentale de ces méthodes, cependant, sont attribués à l'exigence des molécules de marquage de surface. Diélectrophorèse (DEP) a été identifiée comme alternative sans marquage prometteuse. Cette thèse porte sur l'amélioration des technologies basée sur les DEP actuelles, et le développement d'une nouvelle méthode pour aborder les questions de cytometrie diélectrophorétique (DEP) permettant la mesure probabiliste des signatures diélectriques (DE) de cellules au niveau d’une population, ainsi que de permettre l'identification de biomarqueurs fiables pour les changements cellulaires.Tout d'abord, les améliorations de la cytométrie DEP sur la translation de cellules latérales induites par DEP sont explorées par fabrication. Un système de tri cellulaire benchmark microfluidique est présenté, et l'effet des désalignements des microcanaux sur les topologies des électrodes des cellules DEP vivantes est discuté. Un modèle de S. cerevisiae est présenté et validé expérimentalement dans des dispositifs microfluidiques fabriqués. Un nouveau procédé de fabrication permettant le prototypage rapide de dispositifs microfluidiques avec des électrodes intégrées bien alignées est présenté. Des dispositifs identiques ont été fabriqués avec des procédés standards de lithographie douce PDMS. Selon l'étude benchmark, la procédure standard PDMS est tombée bien en dessous de la gamme nécessaire pour le tri des cellules par DEP. Le temps de fabrication et les coûts de la méthode proposée se sont révélés être à peu près les mêmes.Deuxièmement, une nouvelle méthode appelée cytométrie DEP distribuée (2DEP cytométrie) a été développée. Elle utilise une translation verticale de cellules induite par effet de DEP en liaison avec la vélocimétrie par image de particules (PIV) afin de mesurer la répartition probabiliste de forces DEP sur une population cellulaire entière. La méthode a été intégrée dans un dispositif microfluidique avec des électrodes intégrées. Les cellules passant à travers le micro-canal sont sollicitées par des forces de sédimentation, tandis que les forces DEP soit s’opposent à la sédimentation, prennent en charge la sédimentation, ou aucun des deux, en fonction des signatures DE des cellules. Les hauteurs à laquelle les cellules se stabilisent correspondent à leur signature DE et sont mesurées indirectement en utilisant PIV.Les données expérimentales quantifient la signature DE d'une population de S. cerevisiae et la lignée cellulaire human immortalise leucemie myeloide K562. Tout d'abord, l'effet de la surexpression de certaines protéines membranaires a été étudié dans des cellules S. cerevisiae. La répartition mesurée des forces DEP a été comparée à la population de cellules exprimant une protéine cytoplasmique au même taux. Deuxièmement, 2DEP cytométrie a été appliquée à la lignée cellulaire K562. Les effets de la réponse à un stress provoqué par divers inducteurs sur la signature DE de la population cellulaire ont été analysées.Enfin, l'analyse statistique des données définies estimation par noyau ajustées pour surmonter la nature finie des données mesurées. En combinaison avec des spectres en distance de Wasserstein, notés signatures Wasserstein, ont été quantifiés et liée à certains changements cellulaires. Ces signatures peuvent être utilisées comme marqueurs biologiques fiables pour certains changements cellulaires.En conclusion, 2DEP cytométrie a montré être suffisamment sensible pour identifier certains changements d’états cellulaires. Le nouveau dispositif 2DEP cytométrie est donc une alternative prometteuse à la cytométrie en flux classiqu