Implication de l’interférence entre réplication et transcription au cours du développement du cancer

Genome instability is a hallmark of cancer cells. It has been proposed that at early stages of the cancer process, genomic instability is caused by oncogene-induced replication stress, a poorly-understood process characterized with the accumulation of stalled replication forks and gammaH2AX on chromatin. Understanding the origin of chronic replication stress represents a major challenge in cancer biology. We have previously shown that depletion of DNA Topoisomerase 1 or the splicing factor ASF/SF2 in mammalian cells interferes with replication fork progression, activating the DNA damage response and inducing chromosome breaks (Tuduri et al., 2009). Since DNA damage and replication fork stalling are relieved by RNaseH1, an attractive hypothesis could be that replication stress is caused by R-loops. These RNA-DNA hybrid structures form when nascent RNA re-anneals to the template DNA strand, leaving the non-template strand unpaired. Using immunofluorescence confocal microscopy with the S9.6 antibody that recognizes RNA-DNA hybrids, we confirmed that R-loops accumulate in ASF/SF2 and Top1-depleted HeLa cells. Since R-loops are enriched at specific sites in the human genome, wecombined different genomic approaches, including DRIP-seq (R-loops), ChIP-seq (gammaH2AX, pRPA) and BLESS (DSBs; Crosetto et al., Nature Methods, 2013) to monitor their distribution relative to replication stress markers and DNA double-strand breaks (DSBs) in the absence of Top1 or ASF/SF2. . Our data reveal a significant correlation between replication stress and cotranscriptional R-loops, supporting the view that the interference between replication and transcription promotes genomic instability in human cells. However, not all R-loops forming regions colocalize with replication stress since these structures have multiple physiological roles. This approach allowed us to determine the conditions in which R-loops may represent a threat to genome integrity. Moreover, we also observed the accumulation of R-loops in immortalized fibroblasts expressing an oncogenic form of Ras and in preplasmablast during plasma cell differentiation, a crucial process during which multiple myeloma may evolve. In clonclusion, our data indicate that R-loops may represent an important source of oncogene-induced replication stress.L’instabilité génomique est une caractéristique majeure des cellules cancéreuses. Dans les premières étapes du développement du cancer, l’activation des oncogènes induit du stress réplicatif à l’origine de cette instabilité. Le mécanisme par lequel la dérégulation des oncogènes induit un blocage des fourches de réplication et du gammaH2AX sur la chromatine reste peu compris. Ainsi déterminer l'origine de ce stress réplicatif dans les cellules précancéreuses est donc essentiel afin de mieux comprendre les premières étapes de la tumorigenèse. Il a été montré dans notre laboratoire que la déplétion dans des cellules humaines de la topoisomérase 1 ou du facteur d’épissage ASF/SF2 perturbe la progression des fourches de réplication, active le checkpoint de phase S et induit des cassures chromosomiques (Tuduri et al., 2009). Puisque les dommages à l’ADN et les défauts de réplication sont corrigés par la RNase H1, il est possible que ce stress réplicatif soit dû à la formation de R-loops. Ces hybrides ADN/ARN se forment au cours de la transcription lorsque l’ARN naissant revient s’hybrider avec sa matrice d’ADN laissant le brin non-transcrit sous forme simple brin. Les R-loops se formant dans des sites spécifiques du génome, nous avons alors cartographié leurs distributions et l’avons comparé à celle de marqueurs de stress réplicatif et de cassure double brin (CDB) de l’ADN dans nos cellules shASF et shTop1. Nous avons donc combiné différentes approches génomiques comme le DRIP-seq (R-loops), le ChIP-seq (pRPA et gammaH2AX) et le BLESS (CDB ; Crosetto et al., Nature Methods, 2013). Nos données montrent une corrélation importante entre les régions formant du stress réplicatif et la formation de R-loops appuyant l’idée que l’interférence entre réplication et transcription augmente l’instabilité génomique dans les cellules humaines. Toutefois puisque les R-loops ont de multiples rôles physiologiques, toutes régions qui en forment ne corrèlent pas avec l’induction de stress réplicatif. Ce projet devrait nous aider à déterminer dans quelles conditions les R-loops représentent une menace pour l’intégrité du génome. Par microscopie confocale à fluorescence, nous avons confirmé que les R-loops s’accumulaient dans nos lignées HeLa déplétées pour ASF et Top1. A noter que les R-loops s’accumulent également dans des fibroblastes immortalisées exprimant la forme oncogénique de Ras et dans des préplasmablastes, une étape du développement plasmocytaire particulièrement à risque pour le développement de myélome multiple. Ensemble, ces données indiquent que les R-loops pourraient être une source du stress réplicatif induit par les oncogènes